Fabricage van een microfluïdische apparaat voor de compartimentering van Neuron Soma en axonen

Welkom in het laboratorium van Dr. Newly John. Het John Lab is gespecialiseerd in het ontwikkelen van microfluïdische platforms voor biologische toepassingen. In deze video demonstreren we de productie en het gebruik van een microfluïdisch apparaat dat is ontworpen voor het compartimenteren en kweken van primaire neuronen.

Het neuron-apparaat werd voor het eerst gepubliceerd in Nature Methods in augustus 2005. Sinds de introductie is het neuron-apparaat wereldwijd op grote schaal door samenwerkingspartners gebruikt. Het neuron-apparaat bestaat uit een stuk PDMS dat is gegoten op een siliciumwafer met een SUA-patroon van het apparaat, dat vooraf via fotolithografie is gecreëerd.

Het apparaat heeft drie hoofdkenmerken: vier reservoirs met een diameter van 8 mm, twee hoofdkanalen van elk 1,5 mm breed, 7 mm lang en 100 µm hoog, en microgroeven van 10 µm breed en 3 µm hoog die de twee hoofdkanalen met elkaar verbinden. De microgroeven kunnen variëren in lengte van 150 µm tot 900 µm, hoewel de standaardlengte 450 µm is. Wanneer het apparaat zo wordt bekeken dat de hoofdkanalen en de microgroeven verticaal staan, is te zien dat de reservoirs links van de groeven via de hoofdkanalen met elkaar verbonden zijn, evenzo als de reservoirs aan de rechterzijde.

Deze functie maakt het mogelijk dat vloeistof door het hoofdkanaal stroomt, wat een belangrijk kenmerk is dat het mogelijk maakt om cellen te laden en media te vervangen. Het neuron-apparaat biedt drie grote voordelen ten opzichte van traditionele weefselkweekplatformen. Ten eerste maakt het de compartimentering van cellichamen of soma en de axonen mogelijk. Met het neuron-apparaat is het mogelijk om zuivere axonale fracties te verkrijgen.

De grootte en lengte van de microgroeven maken het mogelijk dat axonen door het andere hoofdkanaal passeren, terwijl wordt voorkomen dat de cellichamen oversteken. Ten tweede is het, dankzij het ontwerp van het apparaat en door gebruik te maken van hydrostatische druk, mogelijk om zowel de celzijde als de axonzijde van het apparaat aan afzonderlijke behandelingen te onderwerpen, simpelweg door het volume in de reservoirs aan de ene zijde van het apparaat hoger te houden dan aan de andere zijde. En ten derde kan de zuivere axonale fractie van het apparaat door vacuümsuiging worden afgesneden, waardoor de onderzoeker axonale regeneratie kan bestuderen en observeren.

Onderzoeker Hina Lee zal nu het voorbereiden van het microfluïdische neuron-apparaat demonstreren. Een siliciumwafer van 3 Å met een patroon van SU-8, vervaardigd via fotolithografie, wordt gebruikt om de poly-dimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische mal te gieten. We noemen de siliciumwafer met het SU-8-patroon de mastermallen of kortweg de masters.

PDMS wordt gemengd met een uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1. Dat is bijvoorbeeld 15 gram PDMS per 1,5 gram uithardingsmiddel. De PDMS wordt vervolgens goed gemengd en op de silicon wafer gegoten.

De siliciumwafer bevindt zich in een polystyreen petrischaal van 10 centimeter. Er is ongeveer 12 gram tot 15 gram PDMS nodig om de MA's te bedekken met een dikte van ongeveer vier millimeter. De master met de PDMS wordt vervolgens in een vacuümdesiccator geplaatst met het deksel van de petrischaal verwijderd, waarna er vacuüm wordt aangelegd.

Dit wordt gedaan om luchtbellen te verwijderen uit de PDMS die zijn ontstaan tijdens het roeren van het uithardingsmiddel. Het duurt ongeveer 15 minuten voordat de luchtbellen zijn verwijderd. De master met PDMS wordt na 15 minuten in de vacuümdesiccator uit de desiccator gehaald.

Er zijn nog enkele luchtbellen aanwezig op de PDMS-master. Een persluchtpistool met een filter van 0,45 micron wordt gebruikt om de resterende bellen te verwijderen. De master wordt vervolgens gedurende één uur op een warmteplaat van 80 °C geplaatst om te uitharden.

Als er geen vacuümdesiccator beschikbaar is, kan het mengsel enkele uren op kamertemperatuur blijven staan. De luchtbellen zullen uiteindelijk vanzelf verdwijnen. Indien er geen warmteplaat beschikbaar is, zal de PDMS na 24 uur uitharden bij kamertemperatuur.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de master waterpas staat tijdens het uithardingsproces. Zodra de PDMS op de master is uitgehard, wordt deze met een chirurgisch scalpeltje naar een cleanbench gebracht. Er wordt een cirkelvormige snede rondom de rand van de devices gemaakt.

Het is belangrijk dat men het mes in de PDMS steekt om contact te maken met de siliciumwafer, maar er mag niet te veel druk op de wafer worden uitgeoefend, anders zal de master barsten met een cirkelvormige snede rondom de apparaten. Er bevinden zich vier apparaten op elke siliciummaster van drie inch. De PDMS wordt voorzichtig van de master getild.

Dit kan worden gestart door het chirurgische mesje voorzichtig te draaien terwijl het in de eerdere snede wordt ingebracht. Het is erg dun met de PDMS-apparaten op de mal. Reservoirs aan de bovenzijde worden in het apparaat geponst met een weefselbiopsieponser van acht millimeter.

Het residu dat in de pons achterblijft, wordt met een staafje naar buiten geduwd. De apparaten worden vervolgens in vieren gedeeld en overtollig PDMS wordt weggesneden, zodat het apparaat precies op een Corning-dekglaasje past. Glas nummer één van 24 millimeter bij 40 millimeter stikstoflucht wordt gebruikt om eventueel resterend vuil weg te blazen.

Hardnekkig vuil kan ook worden verwijderd met behulp van 3M Scotch Brand 4 7 1 vinyltape. De schone apparaten zijn nu klaar voor plasmabinding. Een Herrick plasma cleaner wordt kortstondig gebruikt om de neuron-apparaten aan de dekglasplaatjes te binden.

De apparaten en de dekglasjes worden op een plateau geplaatst, waarna het plateau in de plasmareiniger wordt geplaatst en een vacuümpomp wordt gebruikt om de lucht uit de kamer te onttrekken. Het is belangrijk op te merken dat de PDMS-apparaten met de voorkant naar boven worden geplaatst. Dit betekent dat de zijde met het ontwerp naar boven is gericht, zodat deze wordt blootgesteld aan het plasmagas.

Nadat de vacuümdruk 300 millitorr heeft bereikt, wordt de stroom naar de elektrische spoel ingeschakeld en op hoog ingesteld. De deur wordt op een kier gezet om een kleine hoeveelheid lucht in de kamer toe te laten, wat helpt bij het genereren van het plasma. De apparaten en het dekglas worden gedurende twee minuten met plasma behandeld.

Let op de paarse kleur in de kamer. Dat is het eigenlijke plasma. De elektrische spoel creëert plasma, wat een gedeeltelijk geïoniseerd gas is dat bestaat uit elektronen, ionen en neutrale atomen of moleculen.

Het plasma creëert reactieve species op het oppervlak van het glas en het apparaat, die een permanente verbinding vormen wanneer ze samen worden geplaatst. Het plasma maakt het oppervlak daarnaast hydrofiel, wat de toevoeging van vloeistoffen vergemakkelijkt. De plasmareiniger steriliseert tevens de apparaten.

Na een plasmabehandeling van twee minuten wordt de stroom van het vacuüm uitgeschakeld en wordt er lucht in de kamer geleid. De plasmabehandelde oppervlakken van het glas en het microfluïdische apparaat worden in een cleanbench met elkaar in contact gebracht en gemonteerd. De apparaten worden vervolgens in steriele schalen van 60 millimeter geplaatst.

De plasmabehandelde oppervlakken van het glas en het apparaat vormen een sterke, onomkeerbare verbinding. Binnen 10 minuten na de plasmabinding wordt polyollysine aan het apparaat toegevoegd dat aan het glas is bevestigd. Na 10 minuten zal de hydrofiliteit van het apparaat afnemen.

Hierdoor wordt het voor de PLL moeilijk om het apparaat binnen te dringen. Het is belangrijk om na de toevoeging van PLL te controleren op luchtbellen in het apparaat. Een eenvoudige methode om aanwezige luchtbellen te verwijderen is het gebruik van een P 200 pipet gevuld met 100 µL vloeistof.

In dit geval plaatst u de tip van de PLL direct bij de opening van het hoofdkanaal en drukt u vervolgens krachtig op de P 200. Dit moet mogelijk enkele keren worden herhaald, maar uiteindelijk zal de kracht van de pipet de luchtbellen naar buiten drijven. De apparaten die PLL bevatten, mogen een nacht incuberen in een standaard weefselkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.

Na 24 uur incubatie met PLL worden de apparaten twee keer snel gespoeld met gedeïoniseerd autoclaafwater. Tijdens dit proces wordt vloeistof nooit volledig uit de hoofdkanalen verwijderd, enkel uit de reservoirs. Het verwijderen van vloeistof uit de hoofdkanalen zal leiden tot de vorming van luchtbellen.

Na twee korte spoelingen worden de apparaten opnieuw gevuld met gedeïoniseerd autoclaafwater en minimaal drie uur of een nacht teruggeplaatst in de incubator. De volgende dag, nadat de apparaten een nacht of minimaal drie uur met water zijn geïncubeerd, worden ze opnieuw in de veiligheidskast geplaatst en twee keer gespoeld met gedeïoniseerd water. Vervolgens wordt neuraal basaal medium, mengandung de benodigde supplementen B 27 en glutamaat voor het kweken van primaire ratneuronen, aan de apparaten toegevoegd.

De apparaten worden vervolgens teruggeplaatst in de incubator voor toekomstig gebruik. De apparaten zijn nu klaar voor het uitplaten van neuronen. In deze video hebben we de techniek van soft-lithografie gedemonstreerd, die we gebruiken voor de productie van onze neuron-apparaten.

Deze apparaten kunnen worden gebruikt voor het kweken van neuronen en andere cellen van belang. Het primaire voordeel van deze apparaten is de mogelijkheid om de kweek van de neuronale cellichamen aan de ene zijde van het apparaat te scheiden en te compartimenteren van een zuivere axonale fractie aan de andere zijde van het apparaat. In de volgende video laten we zien hoe we corticale neuronen van foetale ratten (E 18) prepareren en hoe we de cellen in het apparaat laden.

Dat is alles vanuit het John Lab. Bedankt voor het kijken.