Het tellen van menselijke neurale stamcellen
22 augustus 2007
Kennis van het exacte aantal levensvatbare cellen is nodig voor vele weefselkweek manipulaties. Dit protocol beschrijft hoe onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren cellen met behulp van een hemacytometer. Hoewel het beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), kan het worden gebruikt voor andere celtypen.
Nu ga ik laten zien hoe u menselijke neuro-precursorcellen telt. U telt uw cellen wanneer u deze wilt voorbereiden voor immunochemie of wanneer u een transfectie wilt uitvoeren met nuclear factor machine. Ik gebruik een fasecontrast-hemocytometer met een randrooster en we gebruiken ook een kleurstof genaamd trypaanblauw. Deze kleurstof is nuttig omdat deze een onderscheid kan maken tussen levende en dode cellen.
Dode of stervende cellen nemen deze kleurstof op en kleuren blauw. Wanneer u de cellen in de hemocytometer bekijkt, blijken levende cellen deze kleurstof uit te sluiten en kleuren zij niet blauw. Op die manier kunt u de levensvatbaarheid van uw cellen bepalen om een oplossing van trypaanblauw in medium te bereiden.
Ik voeg 20 µL van de trap en blauwe oplossing toe aan deze 0,5 ml epi-tube. Vervolgens voeg ik 25 µL medium toe. Op die manier heb ik nu 45 µL van een trapaanblauw- en mediumoplossing, zodat ik een 1:10 verdunning krijg wanneer ik 5 µL cel-suspensie toevoeg.
Ik ga nu 5 µL celсусpensie toevoegen. Eerst zorg ik ervoor dat de cellen goed zijn geresuspendeerd door middel van finger vortexing. Ik wil nu controleren of deze oplossing goed is gemengd.
Ik zal de tafel nu een paar keer omhoog en omlaag bewegen. Tot slot breng ik ongeveer 12 µL van deze celconcentratie aan in een hemocytometer. Deze heeft twee poorten en u kunt beide gebruiken.
Alles wat u hoeft te doen is de oplossing bij deze poort aan te brengen, waarna de vloeistof door capillaire werking wordt opgezogen. Nu ben ik klaar om te tellen. Hier is een beeld van de hemocytometer bij 10 x en hier zien we een kwadrant dat 16 vierkantjes bevat.
En zoals u kunt zien, kunnen we hier levende en dode cellen waarnemen. Hier hebben we levende cellen zoals deze, deze en deze. En we hebben ook enkele dode cellen, zoals deze.
Zoals u ziet, lijkt de dode cel donkerblauw, terwijl de levende cellen een soort halo om zich heen hebben. Ik ga nu alle levende cellen tellen. Ik doe dit van links naar rechts en van boven naar beneden.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. We hebben in totaal dus zesendertig cellen in dit kwadrant. Wanneer ik cellen zie die op de grens van het kwadrant liggen, zoals langs deze lijn hier, tel ik voor de consistentie de cellen op de linkerborder en de bovenborder mee.
En ik tel consequent de cellen op die grenzen voor alle kwadranten op de hemocytometer. Nu gaan we berekenen hoeveel cellen we per microliter hebben. Om dat te doen neem ik het gemiddelde aantal cellen per kwadrant, wat 38 is, en vermenigvuldig dit met 10, een factor die is bepaald door de afmetingen van de kamer.
Vervolgens vermenigvuldigen we dit met 10, wat in dit geval onze verdunningsfactor is. Uiteindelijk verkrijgen we het aantal cellen per microliter. In dit geval hebben we 3.800 cellen per microliter.
En aangezien we ons celpellet hebben geresuspendeerd in 500 µL oplossing, kunt u berekenen hoeveel cellen u in totaal heeft. Dan zijn we klaar.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het tellen van humane neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) met behulp van een hemocytometer. Er wordt nadruk gelegd op het belang van het onderscheid tussen levende en dode cellen voor diverse weefselkweektoepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Weefselkweek
Achtergrond
- Het aantal levensvatbare cellen is cruciaal voor manipulaties in weefselkweek.
- Levende cellen kunnen bepaalde kleurstoffen uitsluiten, terwijl dode cellen dat niet kunnen.
- Een hemocytometer is een standaardinstrument voor het tellen van cellen.
- Tryppanblauw-kleurstof wordt veelvuldig gebruikt om de cellevensvatbaarheid te beoordelen.
Doel van de Studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het tellen van hNSPCs.
- Om levende en dode cellen effectief te differentiëren.
- Om onderzoekers te helpen bij de voorbereiding op verdere experimenten, zoals immunochemie of transfectie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een fasecontrast-hemocytometer.
- Toepassing van Trypaanblauw-kleurstof om celviabiliteit te onderscheiden.
- Tellen van cellen onder een microscoop.
- Bereiding van een oplossing van Trypaanblauw en medium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie tussen levende en dode cellen.
- Nauwkeurige kwantificering van hNSPCs.
- Demonstratie van de effectiviteit van trypaanblauw-kleuring.
- Validatie van de hemocytometer als een betrouwbare telmethode.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige aanpak voor het tellen van cellen.
- Het is toepasbaar op diverse celtypen naast hNSPCs.
- Inzicht in de cellevensvatbaarheid is essentieel voor succesvolle weefkulturexperimenten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Nauwkeurige kwantificering van levensvatbare menselijke neurale stam-/precursorcellen (hNSPCs) is essentieel voor reproduceerbare weefselkweekworkflows bij het ontdekken van geneesmiddelen in de neurowetenschappen. Dit protocol maakt een betrouwbare beoordeling van de cellevensvatbaarheid en concentratiemeting mogelijk, wat zorgt voor een consistente experimentele uitzaaiing voor downstream-toepassingen zoals immunocytochemie en transfectie. Door de discriminatie tussen levende en dode cellen te standaardiseren met behulp van Trypanblauw en tellingen met een hemacytometer, verbetert deze methode het voorspellend vertrouwen in vroege stadia van targetvalidatie en pipelines voor assayontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige uitplating van hNSPCs mogelijk voor studies naar target-engagement en pathway-modulatie.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in celgebaseerde assays door een consistente input van levensvatbare cellen te garanderen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare gegevens over de celconcentratie die cruciaal zijn voor de standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Ondersteunt de schaalbare bereiding van celsuspensies voor high-content screening-formaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft de consistentie van de cellulaire input tijdens de overgangsfases van discovery naar preklinisch onderzoek.
- Operationele waarde: Faciliteert cross-functionele samenwerking door gestandaardiseerde praktijken voor het tellen van cellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekking en ondersteunt een betrouwbare celpreparatie, van doelwitvalidatie tot assayoptimalisatie en preklinische werkzaamheidstesten.
- Discovery Biology: Waarborgt een nauwkeurige celdosering voor target-validatie-experimenten met hNSPCs.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare cel-inputs die noodzakelijk zijn voor een reproduceerbare assay-prestatie.
- Analytics: Genereert gegevens over de concentratie levensvatbare cellen en het totale aantal cellen, die worden gebruikt om experimentele condities te normaliseren.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit in de celverwerking tussen in vitro discovery en preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een overdraagbare, laagcomplexe capaciteit die toepasbaar is op meerdere celtypen en projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellende vertrouwen door variabiliteit in celgebaseerde experimentele inputs te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria en teams.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen via betrouwbare assay-fundamenten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk door datakwaliteit te waarborgen bij vroege efficiëntiescreening.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basiskennis van weefselkweektechnieken en microscopie.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van een hemocytometer en een correcte reiniging om contaminatie te voorkomen.
- Vereist consistente training van de operator voor een onbevooroordeelde selectie van kwadranten en strikte regels voor het tellen van de randen.
- Beperkt door de handmatige telcapaciteit; niet geschikt voor high-throughput automatisering zonder aanpassingen.
- Vertrouwt op correcte verdunning en menging om een representatieve bemonstering van de cel-suspensie te garanderen.
