Imaging C. elegans Embryo's met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Dit protocol demonstreert hoe dynamische gebeurtenissen in vroege embryo's van C. elegans kunnen worden gevisualiseerd met Norky DIC-optiek of fluorescentie, gebruikmakend van algemeen beschikbare microscopen en opensourcesoftware. Het protocol begint met een beschrijving van hoe C. elegans-embryo's worden gedissekeerd en gemonteerd voor beeldvorming. Vervolgens wordt de juiste configuratie van de DIC- of Norky-optiek besproken om optimale beelden met de hoogste detaillering te garanderen.

De kalibratie van breedveld epi-fluorescentie en belichting wordt eveneens besproken voor het verzamelen van kwalitatieve fluorescentiebeeldgegevens in combinatie met opensourcesoftware. Goede microscopie kan cellulaire dynamiek in een ontwikkelend embryo visualiseren. Visuele illustraties van deze methode zijn cruciaal, aangezien het correct instellen van de optica lastig is omdat de terminologie verwarrend kan zijn en de juiste techniek moeilijk in geschreven vorm te beschrijven is.

Daarnaast dienen onderzoekers er zorgvuldig op toe te zien dat de blootstelling aan licht tot een minimum wordt beperkt bij het uitvoeren van fluorescentie-imaging. Om fototoxiciteit en fotobleaching te beperken, moeten embryo's voor de imaging worden voorbereid; maak hiervoor eerst twee monteeroplossingen. De ene bestaat uit gesmolten vaseline en de andere uit 2 tot 3% agarose in buffer.

Dichtere aros kunnen worden gemaakt als de te beelden structuren zeer fragiel zijn, waarbij zorgvuldig moet worden vermeden dat de oplossing kookt. Beide stamoplossingen worden in de magnetron gesmolten en vervolgens bewaard als aliquots van vier tot vijf milliliter. Op de dag van beeldvorming wordt een aliquot van de Vaseline-oplossing gesmolten in een warmteblok van 65 tot 70 °C en wordt één aliquot van de arose-oplossing in de magnetron gesmolten.

Voorkom opnieuw dat de vloeistoffen koken. Bewaar deze oplossingen vervolgens in een warmteblok om ze gesmolten te houden. Bedek daarna de boven- en onderkant van twee objectglazen met een strip laboratoriumtape en plaats een schoon objectglas tussen de twee afgeplakte glazen.

Pipette nu een paar druppels van het gesmolten aros op de schone objectglas en dek dit af met een ander schoon objectglas. Het aros verspreidt zich tot een dun vierkant kussen, waarmee het wormkussen is voorbereid. Gebruik een dissectiescoop en een platina draadpincet om twee volwassen wormen over te brengen naar een druppel buffer van 9 tot 12 µL op een dekglas van 18 bij 18 mm.

Snijd vervolgens. Open de wormen met een naald of scalpel om de embryo's vrij te maken, waarbij de agar-zijde naar beneden is gericht. Plaats het wormenblokje op het dekglas van 18 bij 18 millimeter en snijd met een scheermes alle overhangende agar weg.

Breng tenslotte, om het dekglas te verzegelen, de gesmolten vaseline-oplossing langs de rand aan met een penseel of tandenstoker. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming. Let bij het plaatsen van het preparaat op de microscoop erop dat de twee polarisatoren loodrecht op elkaar zijn uitgelijnd.

Zorg ervoor dat zowel de diafragmaschijven als de prisma's buiten het lichtpad zijn. Als het veld niet donker is, draai dan aan de polarisator onder de condensor totdat dit wel het geval is. Zoek de embryo's op met het 10-voudige objectief.

Zoek in de buurt van de wormlichamen naar groepen jonge embryo's om meerdere embryo's binnen het beeldveld te krijgen. Vermijd embryo's die zich nog in de worm bevinden voor de beste beelden. Zodra de beste embryo's zijn gelokaliseerd, schakelt u over naar een objectief met een hogere vergroting.

Schakel nu de filterkubus over naar DIC. Plaats vervolgens het bovenste Wollaston-prisma van het objectief in de lichtweg en draai aan de ring van de condensor om het onderste Wollaston-prisma te selecteren dat overeenkomt met het objectief. Wanneer de prisma's geplaatst zijn, past u de schuifregelaar onder deze revolver aan om deze af te stemmen op de numerieke apertuur van de lens.

Voor een optimale Köhler-verlichting stelt u de condensor scherp totdat de rand van het condensor diafragma het scherpst zichtbaar is. De maximale scherpte is bereikt wanneer de grens tussen licht en donker het meest scherp of in focus is. Voor een optimaal contrast stelt u de aperture opening en het prisma in door aan de knop op de schuifregelaar te draaien.

De microscoop is nu bijna klaar voor gebruik. Het is tijd om aanvullende beeldparameters op de computer te regelen met Micro-Manager en opensourcesoftware. Begin met het instellen van de cameragevin op nul.

Schakel vervolgens over naar het opslaan van bestanden als 8-bit tiff's in plaats van 16-bit. TIFF-bestanden kunnen later worden geanalyseerd met opensourcesoftware zoals Image J. Pas daarna het lichtniveau aan zodat de helderste pixels net onder de verzadigingsgrenzen liggen. Als alles correct is uitgevoerd, zal het beeld er 3D uitzien, waarbij het licht onder een hoek lijkt in te vallen.

Nu het beeld er uitstekend uitziet, selecteert u de embryo's die u wilt afbeelden en tekent u een region of interest. Als de microscoop over een focusmotor beschikt, gebruikt u deze om meerdere brandvlakken per tijdspunt te verzamelen. Open het venster voor multidimensionale acquisitie en stel het bovenste en onderste vlak van de Z-stapel in door aan de focusknop te draaien om het eerste en laatste brandvlak te vinden waarop enkele dooierkorrels scherp zijn gesteld.

Stel de stapgrootte in. Hiermee wordt het aantal verzamelde brandvlakken bepaald. Stel nu een tijdsinterval in dat lang genoeg is om alle brandvlakken te verwerven.

De maximale tijdspunten kunnen zeer hoog worden ingesteld, zodat de software beelden blijft vastleggen totdat deze handmatig wordt gestopt. Stel de software zo in dat alleen het laatst verkregen beeld wordt weergegeven, zodat het proces kan worden gemonitord. Geef de beelden nu een bestandsnaam en begin met het vastleggen van de beelden.

Beeldanalyse wordt kort besproken aan het einde van de volgende sectie. Het maken van een GFP-film is vergelijkbaar met het maken van vier D nor Musky DIC, maar er wordt een configuratiebestand gebruikt waarin de softwarematige aansturing van de fluorescentie-sluiter is opgenomen. Zodra de embryo's zijn gelokaliseerd, moet u controleren of het bovenste walstone-prisma niet in het lichtpad bevindt en de filterkubus omschakelen naar F-I-T-C-G-F-P.

Als dit bij het opstarten niet automatisch door de software is ingesteld, zorg er dan voor dat de camerageving op 255 staat. Een afbeeldingsbestand is ingesteld op het 16-bit tiff-formaat. Schakel nu de transmissielichtbron uit en klik op live imaging.

Pas de intensiteit van de UV-lichtbron en de belichtingstijd aan om een goede signaal-ruisverhouding voor het fluorescentiesignaal te bereiken, maar houd de lichtblootstelling minimaal om de cellen te preserveren. Stel vervolgens het tijdsinterval in. Bepaal het aantal tijdspunten en het aantal brandvlakken en ga nu over tot de beeldacquisitie zoals eerder beschreven.

Gebruik opensourcesoftware om de films te analyseren. Image J met de geïnstalleerde micromanager-plugin. Zeer grote films kunnen ook in Image J worden geïmporteerd met behulp van de loci-plugin. Dit is een wild-type embryo, opgenomen met nor masky en DIC-optiek.

Posterieur bevindt zich rechtsonder en ventraal bevindt zich linksonder. De film toont een reeks beelden in één enkel brandvlak, opgenomen om de 15 seconden. De afspeelsnelheid is ingesteld op 14 frames per seconde.

Dit embryo vertoont fluorescentie tijdens de eerste embryonale deling; hier bevindt de posterieure zijde zich rechtsboven. Deze film toont de veranderingen in één enkel brandvlak elke 10 seconden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het beelden van levende embryo's met behulp van zowel DIC Naski-optica als epifluorescentie om dynamische gebeurtenissen te bestuderen.

We hopen dat u een beter inzicht heeft gekregen in het instellen van DIC Nomar-optiek voor optimale beelden en dat u heeft ingezien dat u hoogwaardige fluorescentiegegevens kunt verkrijgen met behulp van epifluorescentie-belichting, en niet altijd afhankelijk bent van geavanceerdere microscopen. U kunt deze beeldtechnieken ook toepassen om embryo's te bestuderen waarin specifieke genfuncties ontbreken, om zo de genetische vereisten voor uw favoriete processen tijdens de celdeling of ontwikkeling verder te onderzoeken.