In kaart brengen en de toepassing van Enhancer-trap Flippase Expression in larvale en volwassen Drosophila CNS

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van GAL4 te verfijnen door gebruik te maken van weefselspecifieke lipase met GAL80-conversietools. Dit wordt bereikt door een collectie enhancer trap Philippe transgene vliegenlijnen te genereren en het expressiepatroon van lipase in het CZS in elke lijn te bepalen. Met behulp van een GFP-reporter kunnen immunochemie en GFP-rapportages glialen van neuronale expressie onderscheiden om GAL4-expressie te kruisen in lijnen van belang, ET-flip-lijnen, over de vliegen die een GAL80-conversietool in het nageslacht bevatten.

Klonale analyse kan worden gebruikt om de verfijning van GAL4-expressie te analyseren, zoals in het oog. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat enhancer-track-lijnen, samen met GAL80-converterende tools, kunnen worden gebruikt met een uitgebreide collectie GAL4-lijnen die al beschikbaar zijn binnen de vliegengemeenschap. Daarnaast kan dit concept worden uitgebreid naar andere GAL4-UAS-modellen in opkomende modelorganismen, zoals zebravisjes.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij het in kaart brengen van neurale circuits die ten grondslag liggen aan gedrag. Hoewel dit protocol het gebruik van flip base demonstreert in een subset van fotoreceptoren, kan de intersectionele methode worden toegepast op de analyse van andere weefsels, inclusief niet-neurale weefsels, naarmate er meer enhancer trap lipase-lijnen worden gekenmerkt.

GAL4 US is een belangrijke techniek die op grote schaal wordt gebruikt door biologen die met vliegen werken. Een nadeel van de meeste GAL4-lijnen is dat de expressie te breed is om te worden gebruikt voor het in kaart brengen van hersengedrag met behulp van de FLP-methode. Het is niet mogelijk om de GAL4-expressie in de gewenste weefsels nauwkeurig af te stellen zonder een FLP-transgen te gebruiken om de expressie van GAL4-expressielijnen gedeeltelijk te beperken.

Het is eerst nuttig om het expressiepatroon van het ET flip x twee-transgeen in larven in een laat ontwikkelingsstadium en in volwassenen te kennen om de expressie van flip a in het CZS te visualiseren. Zet een kruising op tussen mannetjes met het ET t flip X twee-transgeen van belang en maagdelijke vrouwtjes die een GFP-reporter voor et-flip-expressie dragen. Verzamel dwalende F1-larven in het derde stadium voor dissectie. Plaats deze in een schone S-guard schaal, verwijder eventueel vuil met een penseel en spoel de schaal eenmaal af met 1× PBS.

Vul de schaal nu met ijskoud 1× PBS om de larven te anesthetiseren. Om het CZS van een larve te bereiken, houdt u de mondhaak vast met een pincet. Pak de cuticula nabij de uitstekende anterior sfeer vast en pel deze naar achteren. Het CZS blijft samen met enkele andere structuren aan de mondhaak bevestigd.

Verwijder nu met een pincet alle overtollige structuren rondom het CZW terwijl u het CZW disseceert. Breng deze individueel over naar een Pyrex-schaal gevuld met PBS. Zodra alle CZW's zijn gedisseceerd, fixeer uncomplicated deze door ze volledig onder te dompelen in 200 µL 4% PFA op ijs.

Als een CZS drijft, is het niet volledig gereinigd van al het omringende weefsel. Mocht dit gebeuren, gebruik dan een pincet om het CZS opnieuw in het fixeerder te dompelen na fixatie gedurende 15 minuten, was het weefsel 3 keer met ijskoud PBS en was het weefsel vervolgens nog drie keer in ijskoud PBT. Het weefsel is nu klaar om te worden afgebeeld, te worden gelabeld met antilichamen of om later te worden bewaard in PBT bij vier graden Celsius.

Kleuring van dezelfde kruising die is gebruikt om larven te maken; verzamel F1-adulten vóór de dissectie. Dompel vijf tot 10 vliegen gedurende 30 seconden onder in gekoelde 95% ethanol om de waslaag op het oppervlak van de cuticula te verwijderen. Om de ethanol te verwijderen, was de adulten drie keer met ijskoud 1x PBS en breng na de derde wasbeurt één van hen over naar een sil guard-schaaltje van 35 millimeter gevuld met ijskoud 1x PBS om de adult voor te bereiden voor dissectie.

Plaats het dier met de ventrale zijde naar boven en steek een minion-pin in het midden van het abdomen. Begin de dissectie door de poten met een pincet te verwijderen. Verwijder vervolgens de cuticula van de kop door de kop bij de steunen vast te zetten en tegelijkertijd de cuticula van onder het oog naar de bovenkant van de kop af te pellen.

Verwijder voorzichtig met scherpe pincetten het omliggende vetweefsel van de hersenen, aangezien vetweefsel een sterke autofluorescentie vertoont en ervoor zorgt dat de hersenen gaan drijven tijdens het fixeren. De hersenen vormen slechts een deel van het volwassen CZS. Het andere deel is het ventrale zenuwkoord of VNC in de thorax, dat ook gedissekeerd moet worden.

Verwijder eerst de thoracale cuticula door de vlieg bij de basis van het achterpootje vast te zetten en de thoracale cuticula voorzichtig af te trekken tot aan de basis van de nek. Ten tweede: spreid voorzichtig de twee helften van de thoracale cuticula om het VNC bloot te leggen. Ten derde: verwijder het abdomen van de thorax door dit bij de basis van het tweede pootje vast te zetten en het abdomen weg te trekken vanaf nabij het eerste abdominale segment.

Ten vierde wordt de VNC gereinigd door deze bij het humeraal gebied vast te zetten en het weefsel rondom de VNC voorzichtig weg te scheuren. Scheur de ring van bindweefsel rondom het cervicale bindweefsel open en ga verder met het verwijderen van overtollig weefsel terwijl u de hersenen verzamelt. Breng de hersenen en de VNC als paren over naar een Pyrex-schaal van negen wellen, gevuld met gekoelde 1× PBS en op ijs bewaard.

Om de weefsels van de volwassenen te fixeren, worden deze gedurende 15 minuten op ijs ondergedompeld in 4% PFA. Volg dit bad met drie wasbeurten met ijskoude PBS en drie wasbeurten met PBT. Het weefsel is nu klaar om te worden afgebeeld of gelabeld met antilichamen om de expressie van het transgen nauwkeurig te analyseren.

Het is nuttig om het CZS te labelen met neuronale of gliale markers om een referentiekader te bieden; begin met het incuberen van het weefsel gedurende een nacht bij vier graden Celsius met antilichamen tegen respectievelijk neuronen of glia. Was de preparatie de volgende dag vijf keer met PBT en incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur met het fluorescerende secundaire antilichaam. Wikkel de plaat in folie om fotobleken van het antilichaam na afloop van de incubatie te voorkomen.

Was het preparaat met PBS en monteer het preparaat volledig op een objectglas. Gebruik een OSHA-plastic ring om te voorkomen dat het weefsel door het dekglas wordt geplet. Het zenuwstelsel is nu klaar om onder een fluorescentiemicroscoop te worden onderzocht op GFP- en LL-expressiepatronen.

Meestal worden drie tot vijf replica's onderzocht om de reproduceerbaarheid van het expressiepatroon van flip te bepalen. Het expressiepatroon van flip in de flip-lijn kan samen met andere transgenen worden gebruikt om de wijze waarop de GAL four-repressor GAL 80 tot expressie komt te veranderen. Het wijzigen van de expressie van de GAL 80-repressor is een effectieve methode om aanpassingen door te voeren.

Bij GAL4-expressie is een methode om de expressie van GAL80 uit te schakelen (flip-out) met een transgen; GAL80-expressie inactiveert GAL4, dat anders oogdegeneratie in het gehele oog zou stimuleren. De ET-flip-lijn hash 6 88 A wordt hier gebruikt om de effectiviteit van de GAL80-conversietool in een subset van fotoreceptoren in het F1-nageslacht te evalueren, waarbij het oogfenotype wordt vergeleken met het oogfenotype van de ouderlijke stammen. Elke verschijning van oogmisvorming of depigmentatie bevestigt dat het flip-expressiepatroon aanwezig is in de fotoreceptoren en dat de GAL80-flip-out succesvol was.

Een complementaire, niet-redundante strategie is om de expressie van GAL 80 om te keren met behulp van dezelfde flip-lijn van belang. Deze strategie is zeer vergelijkbaar met de andere, maar nu worden de ID-pigmentatie en degeneratie in de F1-nakomelingen onderdrukt. In flip X twee.

Expressie van fotoreceptoren Zodra de techniek onder de knie is, kan de dissectie van het CZS in ongeveer vijf minuten voor volwassenen en één minuut voor larven worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om scherpe pincetten te gebruiken om de trachea en het weefsel rondom zowel volwassenen als Libre C en Ss te verwijderen. Het is belangrijk om een schaal zonder fixatief voor de dissectie te gebruiken. De heat shock flip-methode wordt momenteel gebruikt om willekeurige klonen te genereren.

In tegenstelling hiermee maakt enhancer trap flip het mogelijk om reproduceerbare klonen te genereren, waardoor morfologische en gedragsmatige analyse wordt vergemakkelijkt. Een ander voordeel van de finger-methode is dat men de GAL4-expressiepatronen verder kan beperken door gebruik te maken van aanvullende enhancer trap flip-lijnen en andere GAL-lijnen. Een nadeel van de tubuline-stop GAL80-configuratie is dat bepaalde combinaties van GAL4- en UAS-effectoren, zoals GAL4 en UAS-Kir, niet compatibel zijn omdat ze de vliegen doden.

Dit probleem kan eenvoudig worden overwonnen door gebruik te maken van een conditionele UAS-effector, zoals UAS Shiri Ts, waardoor een gedrag bij restrictieve temperaturen kan worden onderzocht. Zoals verwacht zullen niet alle enhancer trap lipase-lijnen voldoende hoge niveaus van lipase tot expressie brengen om nuttig te zijn. Desalniettemin biedt de hier beschreven vingertechniek een nieuwe benadering voor drosophila-onderzoekers om mozaïekanalyse te verfijnen voor zowel ontwikkelingscircuits als gedrag.