Procedure voor Lung Techniek

Het algemene doel van deze procedure is om in kweek longweefsel te genereren dat morfologisch en fysiologisch vergelijkbaar is met inheems longweefsel. Dit wordt bereikt door eerst het hart en de longen van een volwassen rat te oogsten. De volgende stap is het canuleren van de arteria pulmonalis en de trachea, en het aansluiten van de gecanuleerde longen op een bioreactor voor decellularisatie.

Na de decellularisatie en het spoelen wordt de long overgebracht naar een steriele kweekbioreactor en klaargemaakt voor het zaaien. De laatste stap van de procedure is het zaaien van het gewenste compartiment van de long met een voorbereide celpopulatie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die aantonen dat de gedecellulariseerde extracellulaire matrix efficiënt is herbevolkt met cellen die regionaal specifieke longmarkers tot expressie brengen, zichtbaar via immunofluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het in vitro kweken van longcellen is dat de cellen gedifferentieerde fenotypes gedurende een langere periode behouden, waardoor ze gedurende enkele weken kunnen worden bestudeerd in een driedimensionaal biologisch afgeleid substraat. Voor de decellularisatie worden de longen via de vasculaire canule verbonden met de dop van de bioreactor, en wordt de dop verbonden met het decellularisatieapparaat. De glazen fles boven de longen wordt op zijn plaats gehouden door een ringstatief en een bevestigingsklem.

Op dit punt kan het cellulaire materiaal worden verwijderd om een scaffold van de extracellulaire matrix te produceren, die vervolgens opnieuw kan worden bevolkt met cellulair materiaal. De assemblage van de bioreactor voor het zaaien en kweken van technisch vervaardigd longweefsel wordt in dit diagram getoond. De luer-lockkoppeling van de tracheacannule is verbonden met een ademhalingsloop tussen het tracheareservoir en de hoofdkamer.

De ademhalingsloop bevat twee eenwegkleppen. Deze zijn zodanig geplaatst dat het medium een verschillend pad volgt bij het binnengaan en verlaten van de long. Een klein reservoir is tijdelijk in de perfusielijn geïntegreerd voor het zaaien van endotheelcellen.

Een pulserende pomp wordt gebruikt om cellen van het reservoir naar het vasculaire compartiment van de long te transporteren. De vasculaire perfusie wordt verzorgd door een slangpomp. Medium wordt via de bevestigde canule in de longslagader geparfundeerd, stroomt door de longvasculatuur en via de longader direct terug in de hoofdbioreactor, waar het medium wordt opgezogen voor perfusie.

Het longepitheel wordt door injectie in de ademhalingslus geplaatst. De hoofdkamer die de long bevat en het trachea-reservoir worden gebruikt voor langdurige longkweek. Wanneer de longen zijn uitgenomen en de arterie en trachea correct zijn gecannuleerd, moeten de vers uitgenomen longen lucht kunnen vasthouden zonder te lekken.

Dit kan worden geverifieerd door ze met lucht op te blazen terwijl ze zijn ondergedompeld in vloeistof. Er mogen geen bellen verschijnen die duiden op luchtlekken. Om het protocol te starten, worden de longen opgeblazen met PBS dat natriumnitroprusside bevat totdat de longen vol zijn maar niet overvuld; sluit direct daarna de tracheale canule af zodat de longen opgeblazen blijven.

Perfuseer vervolgens de longen met PBS en SNP gedurende ten minste 15 minuten bij 15 millimeter kwik. Verwijder daarna de stop uit de tracheale canule om de longen te laten leeglopen. Zet de perfusie met PBS en SNP indien nodig voort gedurende 15 tot 30 minuten.

Vul de PBS en SNP bij om ervoor te zorgen dat de perfusiedruk gehandhaafd blijft op 10 tot 15 millimeter kwik. Om de procedure voor langdurige decellularisatie te starten, wordt de dop van de bioreactor verbonden met het decellularisatieapparaat. Vervolgens worden de longen aan de dop verbonden.

Met gebruik van de lure-lockverbindingen die zijn gekoppeld aan de Y-vormige canule, dient de longslagadercanule te worden aangesloten op de perfusielijn en moet de trachea-canule vrij kunnen bewegen. Om volledige decellularisatie van het weefsel te waarborgen, is het cruciaal om lucht uit het systeem te houden. De eenrichtingskleppen in de arteriële en tracheale canule helpen luchtbellen in de slang te verwijderen door een omkeerstroming in de slang mogelijk te maken.

Verwijder daarom eventuele luchtbellen met een spuit en zorg ervoor dat alle lijnen luchtvrij zijn. Start de perfusie met de decellularisatie-oplossing. Perfuseer met de decellularisatie-oplossing.

Totdat er 500 milliliters oplossing door de longen is geperfundeerd, is de optimale druk lager dan 15 millimeters kwik. Dit zal doorgaans 2,5 uur in beslag nemen. De stroomsnelheden zijn aanvankelijk meestal zeer laag en worden tijdens het tweede uur snel verhoogd tot ongeveer een milliliter per minuut of meer.

Verwijder tijdens de perfusie periodiek het gebruikte decellularisatievloeistof uit de bioreactor, waarbij wordt gewaarborgd dat er voldoende vloeistof overblijft om de long- en tracheacanule te ondersteunen. Wanneer de perfusie met de decellularisatievloeistof is voltooid, worden de longen en de bioreactor overgebracht naar een weefselkweekkast. Om het spoelen van het orgaan te beginnen, wordt de pot van 500 milliliter met de decellularisatievloeistof verwijderd en vervangen door een steriele pot met maximaal één liter steriele PBS.

Gebruik vacuümzuiging of een spuit om er zeker van te zijn dat de lijnen luchtvrij zijn en perfuseer PBS door de vasculatuur bij 10 tot 15 millimeters kwik op dezelfde wijze. Net als bij de decellularisatie dient men met steriele technieken periodiek versleten PBS uit de bioreactor te verwijderen en de PBS-pot te vervangen of bij te vullen. Ga door met spoelen met verse, steriele PBS totdat er ten minste 2,5 liters steriele PBS door de longen is geperfuseerd.

Dit duurt doorgaans twee dagen vanaf het begin van het decellularisatieproces, tot het spoelen is voltooid. Verplaats de longen naar een nieuw steriel bioreactorsysteem met vers PBS plus 10% FBS plus 10% Pen strep; zorg ervoor dat zowel de gehele perfusielus als alle luchtweglijnen met vloeistof zijn gevuld. Vanaf dit punt wordt een pulserende pomp gebruikt om de longen te perfunderen met een snelheid van 5 mm per minuut.

Steriliseer het longextracellulaire matrix-steunstructuur door een nachtelijke perfusie met PBS dat 10% FBS en 10% penicilline-streptomycine bevat. Na voltooiing van deze stap worden de longen gedurende één uur, of totdat de temperatuur is geëquilibreerd, overgebracht naar een incubator van 37 °C. Ter voorbereiding op de behandeling met Ben Nase is de volgende stap het behandelen van de longen met Ben Nase.

Om resterend DNA uit elke long te verwijderen, vult u eerst één spuit van 10 milliliter enkel met voorverwarmde Ben Nase-buffer en één spuit van 10 milliliter met 90 units per milliliter Ben Nase, verdund in Ben Nase-buffer. Stop de perfusie van de longen.

Blaas vervolgens de luchtweg op met Ben Nase-buffer, terwijl u voorkomt dat er lucht in de long wordt geïnjecteerd. Laat de long gedurende één minuut leeglopen. Blaas de long vervolgens op met de Ben Nase-oplossing.

Zorg er opnieuw voor dat er geen lucht in de longen terechtkomt na het opblazen met Ben Nase. Laat de longen gedurende één uur bij 37 °C rusten zonder perfusie of ventilatie. Hervat na dit uur de perfusie met de PBS plus 10%FBS 10%penicilline streptomycine die reeds in de bioreactor aanwezig is, en zet de perfusie voort tot de volgende dag.

Na het spoelen en steriliseren kan het lange extracellulaire matrix-steunmateriaal worden voorbereid voor cellulaire herbevolking. Vervang de P-B-S-F-B-S benzo a-oplossing met 250 milliliters kweekmedium en perfuseer gedurende ten minste één uur voordat de cellen worden geïntroduceerd; vervang dit door vers kweekmedium direct voorafgaand aan het uitzaaien van de cellen.

Veel celbronnen kunnen worden benut voor organoïden. Hier zal het zaaien met een epitheliale celpopulatie worden gedemonstreerd. Bereid eerst een spuit voor met 15 milliliter van een celsuspensie van de gewenste epitheliale celpopulatie.

Vul vervolgens het luchtwegreservoir met 80 milliliters kweekmedium en zorg ervoor dat alle ventilatielijnen vrij zijn van lucht. Plaats de bioreactor daarna in een weefselkweekincubator op 37 degrees Celsius en sluit de spuitpomp voor ventilatie aan. Zaai de cellen in de longen door de 15 milliliter celсусpensie in één snelle bolus in de tracheale canule te injecteren.

Zorg ervoor dat de luchtfilters op de hoofdbioreactor zijn afgedicht. Begin vervolgens onmiddellijk met één enkele langzame inademing met behulp van de spuitenpomp om 60 milliliters lucht uit de hoofdbioreactor te onttrekken met een snelheid van drie milliliters per minuut. Dit zal ongeveer 20 minuten duren.

Laat de longen daarna gedurende ongeveer 18 uur statisch rusten. Begin met een langzame vasculaire perfusie van ongeveer 0,5 milliliters per minuut. Tijdens de organcultuur wordt de perfusie doorgaans uitgevoerd met één tot drie milliliters per minuut.

Bij het gebruik van een rollerpomp tijdens epitheliale culturen wordt ventilatie doorgaans geleverd met een continue snelheid van één ademhaling per minuut en een teugvolume van 5 tot 10 milliliters. Bij het gebruik van een spuitenpomp wordt lucht cyclisch uit de bioreactor getrokken en erin geïnjecteerd om ademhaling te simuleren door af te wisselen tussen negatieve druk en atmosferische druk in de hoofdkamer. Vanwege de noodzaak om de bioreactor tijdens de ventilatie luchtdicht te houden, moet de ventilatie dagelijks worden onderbroken en moet de lucht in de hoofdkamer worden ververst.

Bovendien moet het medium ongeveer elke drie tot vier dagen worden ververst. Tijdens de kweek moet telkens ongeveer de helft van het totale volume worden vervangen door het kweken van longepitheel en vasculair endotheel. Met de in de bioreactor gemonteerde steiger zijn wij in staat om longweefsel te genereren dat gedurende korte tijdsintervallen kan deelnemen aan gasuitwisseling.

Een standaard hematoxyline- en eosinekleuring van een natuurlijke ratlong wordt hier getoond ter vergelijking met een H&E-kleuring van een gedecellulariseerde ratlong. De uiteindelijke gedecellulariseerde extracellulaire matrix moet volledig vrij zijn van cellulair materiaal en de macroscopische, microscopische en ultrastructurele kenmerken van de natuurlijke long behouden. De H&E-kleuring maakt de visualisatie mogelijk van elk restant DNA dat aan het steunsel kleeft als gevolg van onvoldoende decellularisatie of spoeling, wat optimale condities voor celzaaien en de daaropvolgende kweek van de long vereist.

En de bioreactor moet zorgen voor een goede distributie van cellen in alle vijf de lobben van de long en moet een bedekking van ongeveer 70% van het extracellulaire matrix-steunweefsel bieden. Deze afbeeldingen vergelijken de natuurlijke long met de repopulatie-long na kleuring door immunofluorescentie. Voor belangrijke longmarkers is de gekweekte celpopulatie positief voor Clara-cel secretorisch proteïne pro secretorisch proteïne C en Aquaporine vijf.

De markers van belang zijn in alle panelen in het rood weergegeven en de met DAPI gekleurde kernen zijn in het blauw. Zodra men deze procedure beheerst, kan het proces van decellularisatie tot recellularisatie in vier tot vijf dagen worden voltooid indien dit correct wordt uitgevoerd.