High-throughput meten en indelen van organische P in milieumonsters

Het algemene doel van deze procedure is het classificeren van enzymatisch gehydrolyseerd organisch fosfor in extracten van bodem- of meststalen. Dit wordt bereikt door de monsters eerst te extraheren met een natriumhydroxide-EDTA-oplossing en de pH van de extracten aan te passen. Vervolgens worden deze aangepaste extracten geïncubeerd met twee verschillende enzymoplossingen.

Op een plaat met 96 putjes is de laatste stap het meten van het door het enzym vrijgekomen orthofosfaat met behulp van molybdeenblauw-colorimetrie. Uiteindelijk kunnen de meeste inheemse orthofosfaatmonoësterfosfor- en diesterfosforvormen in bodem- of mestmonsters worden geclassificeerd op basis van de differentiële afgifte van orthofosfaat via de enzymatische hydrolysemethode. Deze methode kan goedkoop worden uitgevoerd in elk standaardlaboratorium.

Het belangrijkste voordeel ten opzichte van bestaande methoden, zoals fosfor 31 kernmagnetische resonantiespectroscopie, is dat het de potentie van inheemse bodemenzymen kan meten om in de toekomst orthofosfaat vrij te maken uit organische erwtenverbindingen. Daarom kunnen gegevens verkregen via deze methode helpen bij het voorspellen van de bodemvruchtbaarheid of het potentieel van de bodem om schadelijke hoeveelheden voor algen beschikbaar orthofosfaat vrij te maken. Voeg 30 milliliter van de 0,25 molaire natriumhydroxide-oplossing toe aan twee gram nat of gedroogd monster in een conische buis van 50 milliliter.

Incubeer onder agitatie gedurende 16 uur bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 3000 ×g gedurende 30 minuten en breng vervolgens 100 µL over naar een microcentrifugebuis van 1,5 mL die reeds acetaatbuffer bevat. Het bijgestelde monster heeft een totaalvolume van 1 mL en een pH van 5,0.

Bereid twee voorraadoplossingen voor met 0,5 units per milliliter zuur fosfatase in 10 milliliter vers bereid 0,1 molair natriumacetaat bij pH 5. Voeg nu gereconstitueerd geliofiliseerd nuclease NP1 uit Penicillium Citron toe aan een van de 10 milliliter buisjes met de zuur fosfatase-voorraad tot een eindconcentratie van 2,5 units NP1 per milliliter; meng dit voorzichtig door enkele keren te inverteren. Centrifugeer de twee enzymoplossingen bij 3000 ×g gedurende 30 minuten. Om een kalibratiecurve te maken, begin dan met het toevoegen van 1 milliliter 1 millimolair kaliumfosfaat-voorraadoplossing aan een 1,5 milliliter centrifugebuisje en voer zeven seriële verdunningen van 0,5 milliliter uit. Gooi het eerste buisje weg, zodat het uiteindelijke verdunningsbereik loopt van 20 µl tot 0,625 nM fosfor.

Breng nu de ORTHOFOSFAAT-standaarden over naar de laatste twee kolommen van de plaat, beginnend met 0 nM orthofosfaat in rij A en eindigend met 20 nM orthofosfaat in rij H in de eerste drie wells van kolom 10. Voeg 40 µL PP plus GP enzymoplossing toe aan de volgende drie wells van kolom 10. Voeg 40 µL PP plus GP plus NP enkel-enzymoplossing toe.

Voeg ten slotte 40 µL van 100 mM acetaatbuffer toe aan alle zes de putjes. Elke van de eerste zes putjes in kolom 10 moet nu 80 µL oplossing bevatten naar de volgende twee putjes. Voeg 40 µL natriumacetaatoplossing toe die 10 M glucose en zes fosfaat bevat, samen met 40 µL PP plus GP enzymoplossing.

Verdeel voor elk te testen monster 40 µL pH-gecorrigeerde monsterextracten over de putjes één tot en met negen in maximaal acht rijen, nadat alle monsters zijn verdeeld. Gebruik een meerkanaals pipet om de PP plus GP enzymoplossing te verdelen over de kolommen één tot en met drie, PP plus GP plus NP over de kolommen vier tot en met zes en 0,1 molar natriumacetaatbuffer over de kolommen zeven tot en met negen. Voer deze stap snel uit om te garanderen dat alle monsters een gelijke incubatietijd krijgen.

Dek de 96-wellplaat af met eenksel en incubeer de monsters, enzymoplossingen, controles en de kalibratiecurve precies één uur lang bij 37 °C in gedeïoniseerd water. Bereid 50 mL van elk van de vier stokoplossingen voor. Oplossing A moet dagelijks snel met een multikanalspipet worden bereid.

Voeg 25 µL SDS, 100 µL van oplossing a, 20 µL van oplossing B en 50 µL van oplossing C toe aan alle wells in de 96-well plaat. Dek de plaat af en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meet tot slot de absorbentie bij 850 nm in een willekeurige instelbare microplate-lezer met behulp van een spreadsheetapplicatie.

Zet eerst de kalibratiecurve voor anorganisch fosfor uit met nul tot 20 nanomoles fosfor op de x-as en het gemiddelde van dubbele absorptiemetingen op de y-as, voer een lineaire regressie uit en bepaal de vergelijking van de beste fit-lijn. Bereken vervolgens het anorganische fosfor in de achtergrond door de waarden in kolommen één tot drie te middelen en vervolgens de kalibratiecurve op de dataset toe te passen. Om het fosfor te bepalen dat is afgeleid van gehydrolyseerde fosformonoësters, worden de waarden van de triplaat la monsters uit kolommen vier tot zes gemiddeld, waarna de controle-enzymoplossing plus het anorganische fosfor in de achtergrond worden afgetrokken.

Om vervolgens het fosforgehalte uit het gehydrolyseerde fosfor te berekenen, berekenen de DER's het gemiddelde van de triplaat-monsterwaarden uit kolom zeven tot negen en trekken daar de controle-enzymoplossing plus achtergrond-anorganisch fosfor plus gehydrolyseerd mono-esterfosfor uit kolommen vier tot zes vanaf. Een typische 96-wells plaat toont resultaten voor acht monsters en een kalibratiecurve. Controles bevinden zich in kolom 10.

De toename in kleurintensiteit tussen kolom één tot drie en vier tot zes is te wijten aan gehydrolyseerde mono-esterfosforverbindingen; tussen kolom vier tot zes en zeven tot negen is deze te wijten aan gehydrolyseerde di-esterfosforverbindingen. Hier werd de methode van high-throughput enzymatische hydrolyse gebruikt om succesvol de distributie van fosforcategorieën in extracten van een Vermont-bodemmonster met 0,25 M natriumhydroxide en 0,05 M EDTA te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u native orthofosfaat, mono-ester- en di-esterfosforverbindingen in bodem- of mestextracten kunt meten met behulp van enzymatische hydrolyse.

Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van milieuvchemie en nutriëntenbeheer om het gedrag van organisch P in bodem- of meststelsels te onderzoeken.