Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)

Secundaire electrospray-ionisatie massaspectrometrie of CS EMS maakt de analyse van bacteriële vluchtige stoffen mogelijk zonder dat er een monsterbehandeling vooraf vereist is. De headspace van de bacteriële cultuur wordt met kooldioxide in de cssi-reactiekamer verplaatst. Terwijl de vluchtige stoffen door de SSI-reactiekamer bewegen, passeren ze de electrospray-wolk en worden ze geïoniseerd.

Zodra ze geïoniseerd zijn, worden de vluchtige stoffen in de massaspectrometer getrokken voor analyse. Overtollig dragergas en niet-reactieve bacteriële vluchtige stoffen passeren een filter van 0,22 micron om eventuele bacteriële agentia te verwijderen als aanvullende beschermingsmaatregel voordat ze naar een chemische zuigkast worden afgevoerd. Uiteindelijk biedt dit CSI MS-protocol bacteriële vluchtige vingerafdrukken binnen enkele minuten.

We verwachten dat deze technologie in veel toepassingen kan worden ingezet, waaronder uitademings- en ademanalyse voor infectieziekten, of zelfs toegepast kan worden op voedselsystemen waarbij we mogelijk pathogenen die op of in ons voedsel zitten snel kunnen detecteren. Er zijn verschillende belangrijke voordelen aan deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals GCMS, sift, MS en PT, RM S; ten eerste vereisen de vluchtige stoffen geen enkele voorbehandeling voorafgaand aan de analyse.

Ten tweede is het mogelijk om specifieke ionen in het vluchtige mengsel te fragmenteren, wat de identificatie van verbindingen vergemakkelijkt. En ten derde is het snel. Meestal duurt het minder dan vijf minuten.

Om elk monster te analyseren, kiest u het juiste vat voor het kweken van uw cultuur, rekening houdend met de groei-eisen van de soort, evenals de efficiënte toevoer van vluchtige stoffen naar de massaspectrometer. In deze demonstratie hebben we standaard pyrex-mediabottels van 100 milliliter geselecteerd. De bacteriële vluchtige stoffen worden door een stroom dragersgas naar de massaspectrometer getransporteerd om de drager te assembleren.

Sluit gasleidingen aan op de kweekflessen met schroefdoppen die ten minste twee luer-poorten hebben. Voer de gasinlaat- en uitlaatleidingen door de luer-poorten en sluit alle overige poorten af voordat u uw monsters kweekt. Zet de vaten onder druk en dompel ze onder in water om op lekken te controleren.

Gaslekken zijn een primaire oorzaak van atypische resultaten in de vorm van zwakke of afwezige vluchtige ionensignalen die gedurende de nacht ontstaan. Culturen van e coli, K 12, en pseudomonas aerogen, PAO one in LB Lennox, waarbij twee biologische replicaten voor elke soort worden voorbereid.

Bereid negen steriele kweekflessen voor met 50 milliliters LB Lennox en één niet-geïnoculeerde fles om als blanco te dienen. Inoculeer elke overnight-cultuur in twee monsterflessen. Maak hiermee technische replica's en incubeer de culturen en de blanco gedurende 24 uur bij 37 degrees Celsius. Aangezien de CEMS specifiek is ontworpen voor het bemonsteren van vluchtige stoffen, dient het gebruik van geurende persoonlijke verzorgingsproducten vlak voor het gebruik van het instrument strikt te worden beperkt.

Sluit alle vluchtige chemicaliën in het laboratorium af en beperk luchtstromen zoveel mogelijk tijdens het testen om contaminatie van uw instrument en de gasoverdrachtsleidingen te voorkomen. Installeer bij gebruik van levensvatige biologische agentia filters met de juiste poriegrootte in de transportgasleiding. De filters zullen de overdracht van vluchtige stoffen naar de sesi-reactiekamer niet hinderen, maar kunnen de efficiëntie van de aerosoloverdracht wel enigszins beïnvloeden.

Om te verifiëren dat de spanningsvoeding is uitgeschakeld en dat het systeem elektrisch ontladen is, dient u te controleren of de indicatielampjes op de spanningsvoeding uitstaan. Controleer of de spanning op de multimeter nul is en aard de elektrische leidingen. Installeer op dit moment de electrospray-oplossing voor analyse.

In positieve ionmodus gebruiken we een electrospray-oplossing van 0,1% mierenzuur, 5% methanol en 94,9% water. Om een optimale signaalintensiteit en stabiliteit te bereiken, schakelt u het kooldioxidedragergas in en stelt u de stroomsnelheid in op twee liter per minuut. Zet druk op het electrospray-reservoir om de toevoer van de electrospray-oplossing naar de reactiekamer te starten met een stroomsnelheid van vijf nanoliter per seconde. Schakel vervolgens de spanningsvoeding in en stel de spanning in op 2,5 kilovolt.

De aangelegde spanning beïnvloedt de signaalintensiteit van de ionen en de stabiliteit van de electrospray Taylor-cone; voor ons systeem bieden spanningen tussen twee en vijf kilovolt de beste resultaten in de positieve ionmodus. Wees voorzichtig, aangezien de metalen oppervlakken van de ionisatiebron op dit punt een gevaarlijke schok kunnen veroorzaken. Stel nu een tuningsmethode in voor het monitoren van het SEMS-spectrum.

Vink het vakje voor multiple channel acquisition of MCA uit. Stel de acquisitietijd in op 10 tot 15 minuten en start de data-acquisitie. Observeer de spectra van de achtergrond van het dragergas en voer fijne aanpassingen uit aan de aangelegde spanning om een stabiel totaal ionenchromatogram en reproduceerbare scans te verkrijgen.

Ga door met het verzamelen van spectra en een TIC gedurende vijf minuten om er zeker van te zijn dat het instrument is gestabiliseerd en dat de instrumentbeveiliging is gewaarborgd. Voer de acquisitieparameters in die geschikt zijn voor uw experiment. Registreer een achtergrondspectrum van het dragergas voor toekomstige experimenten.

Om een blanco spectrum te verzamelen: Leid de stroom van het dragergas door de bypassleidingen en bevestig vervolgens het blanco monster, met de kleppen gesloten, aan de overdrachtsleidingen van het instrument. Open de kleppen naar de monsterfles en sluit de kleppen van de bypassleidingen.

Voor reproduceerbare spectra. Laat het systeem 30 seconden equilibreren, terwijl de vochtigheid in de reactiekamer stabiliseert. Om te controleren of het systeem geëquilibreerd is, dient de TIC te worden gemonitord; deze zal veranderen tijdens de equilibratieperiode en vervolgens stabiliseren.

Zodra het systeem is geëquilibreerd, start u met de verzameling van het spectrum. Nadat het spectrum is verzameld, verwijdert u de monsterfles door eerst de bypassleidingen van het dragergas te openen en vervolgens de monsterventielen te sluiten.

En tot slot het verwijderen van het monsterflesje. Spoel het systeem twee tot vier minuten door met het dragergas om het vocht en de geabsorbeerde vluchtige stoffen uit de transportleidingen te verwijderen en om carry-over tussen monsters te voorkomen. Verzamel vluchtige vingerafdrukgegevens voor elk bacterieel monster, waarbij tussentijds extra blanco spectra worden verzameld om een grondige blanco-subtractie te waarborgen.

De vluchtige vingerafdrukken in de positieve ionmodus voor E. coli en P. aerogen, aeroob gekweekt in LB Lennox gedurende 24 uur bij 37 °C, zijn verschillend. Het vluchtige spectrum van E. coli wordt gedomineerd door indu bij een massa-ladingsverhouding van 118, terwijl het spectrum van Pseudomonas aerogen een grotere variëteit aan toevoegbare eiwitpieken bevat.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk dat u de instrumentele parameters noteert die u voor uw analyse heeft geoptimaliseerd, zoals de aangelegde spanning, de samenstelling van de electrospray-oplossing en de stroomsnelheid van het dragergas. Het is daarnaast belangrijk dat u verslagen bijhoudt van uw representatieve spectra, zodat u uw analyses in de toekomst kunt reproduceren. Vergeet niet dat het werken met pathogene bacteriën en hoge spanning uiterst gevaarlijk kan zijn.

Daarom moeten er altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het beperken van de toegang tot het css CMS tijdens het experiment. Je zou nu in staat moeten zijn om reproduceerbare CSS- en EMS-spectra te verkrijgen voor de bacteriële vluchtige stoffen in je systeem. Veel succes.