Silicon Microchips voor het manipuleren van Cel-cel interactie

Hallo, ik ben Elliot Hu. Ik ben postdoctoral researcher in het laboratorium van Tia hier aan het Massachusetts Institute of Technology. Vandaag gaan we celculturen voorbereiden op silicium micromecanische chips. De apparaten zien eruit als kleine kammen die in elkaar grijpen en stellen ons in staat om de interacties tussen twee verschillende celpopulaties nauwkeurig te manipuleren.

Vandaag gaan we de interactie tussen leverhepatocyten en ondersteunende stromale cellen bestuderen. Specifiek worden 3T3-fibroblastcellen gekweekt op het bovenoppervlak van de kammen, zodat de cellen kunnen worden verplaatst en hun ruimtelijke rangschikking kan worden gewijzigd door de kamtanden te verschuiven. Elk apparaat is verdeeld in twee delen die in twee mogelijke configuraties in elkaar klikken.

De eerste brengt de twee celpopulaties met elkaar in contact. De tweede scheidt de twee populaties enigszins, zodat de cellen elkaar niet kunnen raken. Hierbij worden contactinteracties voorkomen, maar interacties via uitgescheiden factoren behouden.

Laten we beginnen met de manier waarop de onderdelen met pincetten worden gehanteerd. Ik gebruik graag zowel grotere Teflon-pincetten als kleinere metalen pincetten met een ronde punt. Met de grotere pincetten kunt u de onderdelen bij de randen oppakken; bij de grotere onderdelen met armpjes moet u voorzichtig zijn om de armpjes niet te breken, omdat deze zeer fragiel zijn.

U pakt ze dus op aan de achterkant van het onderdeel, zoals hier. Met de pincet van metaal kunt u in het gat reiken en de chips direct oppakken. De grotere onderdelen passen in een wand van een 12-well plaat, terwijl de kleinere onderdelen in een 24-well plaat passen of gekoppeld kunnen worden aan het grotere onderdeel.

In een plaat met 12 putjes gebruik ik gewoonlijk een metalen pincet. Wanneer ik de onderdelen in de plaat hanteer om twee delen in elkaar te klikken, plaats ik gewoonlijk eerst het grootste deel in het putje en duw ik dit helemaal naar één zijde. Vervolgens neem ik het bijbehorende reparatiestuk en plaats ik dit aan de andere zijde van het putje, waarna ik ze naar elkaar toe duw door twee pincetten te gebruiken, waarbij ik in elk gat één pincet steek.

Ik kan de onderdelen nu simpelweg in elkaar vergrendelen, in ofwel de gap-configuratie of de contact-configuratie. Als ik de onderdelen uit elkaar wil halen, trek ik ze eerst naar de gap-configuratie en trek ik het onderdeel vervolgens verticaal omhoog om het te verwijderen. Aangezien de apparaten van silicium zijn gemaakt, moeten ze worden gecoat om een juiste celadhesie mogelijk te maken.

Waarschijnlijk ontvangt u de apparaten al gecoat met polystyreen en plasmabehandeld, dus we gaan ervan uit dat dit ons startpunt is. Allereerst gebruiken we collageen om het oppervlak te coaten waaraan de hepatocyten zullen hechten. We plaatsen de hepatocytenkammen in een oplossing van 50 µg/mL collageen en incuberen deze 45 minuten bij 37 °C.

De fibroblastenkammen hoeven we daarentegen niet te coaten. Na incubatie aspireren we de collageenoplossing en wassen we met water. Nu gaan we de ES-onderdelen in contact met de complementaire delen vergrendelen, zodat we een vlak oppervlak vormen voor het uitzaaien van de cellen.

Eerst vullen we enkele wells met 70% ethanol. Ik plaats een paar in elke well en vergrendel ze vervolgens met elkaar. Na het vergrendelen controleren we de onderdelen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat ze coplanair zijn.

Af en toe kunnen de onderdelen in een verkeerde uitlijning in elkaar grijpen. Onder de microscoop is dan te zien dat ze zich op twee verschillende brandvlakken bevinden. In dat geval scheidt u simpelweg de onderdelen en schuift u ze opnieuw in elkaar. Nadat is gecontroleerd of de uitlijning correct is, laten we de onderdelen een tijdje in ethanol liggen om ze te steriliseren.

Vaak heb ik haast, dus laat ik het slechts 10 minuten weken. Na sterilisatie moet er gespoeld worden. Aspireer de ethanol grondig en was met water, aspireer vervolgens en was opnieuw met water, en aspireer ten slotte het water om dit te vervangen door uw kweekmedium.

Laten we nu de cellen op de apparaten zaaien. Gewoonlijk suspenderen we de cellen in een concentratie van 500.000 cellen per milliliter en pipetteren we met een 12-well plaat één milliliter suspensie over elk kammenpaar. We hebben de fibroblasten dus gezaaid in twee van de wells in een concentratie van 500.000 cellen per milliliter.

Op dezelfde wijze namen we een suspensie van 500 000 hepatocyten per putje en zaaiden deze uit in de andere twee putjes. Voordat we gaan incuberen, schudden we de cellen grondig om ervoor te zorgen dat ze gelijkmatig verdeeld zijn. Ik schud bij voorkeur drie keer verticaal, drie keer horizontaal, en herhaal dit proces drie keer.

Na het schudden plaatsen we het in de incubator en laten we de cellen 15 minuten rusten, waarna we ze opnieuw schudden. Nadat we gedurende één uur elke 15 minuten hebben geschud, aspireren we de celsuspensie af en brengen we een nieuwe suspensie van cellen aan. We herhalen dit proces totdat er een confluente cellaag is ontstaan.

Bij fibroblasten zijn er doorgaans één of twee zaaiingen nodig. Bij hepatocyten kan dit twee tot vier zaaiingen zijn. Om een confluent monolaag te verkrijgen, worden de cellen op een vrij hoge dichtheid gezaaid; schudden zorgt ervoor dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld.

Na het eerste uitplaten wordt een dunne laag cellen gevormd. Let op dat cellen zich alleen hechten aan de vingers die zijn gecoat met polystyreen en collageen. Na het uitplaten van verse cellen en incubatie gedurende nog een uur, opnieuw met schudden om de 15 minuten, wordt de cellaag dichter.

Na de derde passage hebben we een goede celdichtheid, en we kunnen nu stoppen zodra de cellen op de kammen zijn gezaaid. We willen de cellen nu manipuleren naar de gewenste experimentele configuratie. De apparaten worden nu gescheiden van hun complementaire delen en 24 uur geïncubeerd.

Na 24 uur zijn de cellen verspreid om een confluente monolaag over het oppervlak van de kammen te vormen. Nu willen we een co-cultuur vormen. De hepatocytkam en de fibroblastkam worden nu naar dezelfde well overgebracht en in de gewenste beginconfiguratie aan elkaar vergrendeld.

Indien gewenst kan de configuratie na een bepaalde tijd worden gewijzigd. We kunnen bijvoorbeeld na 18 uur overgaan naar de gap-configuratie; de onderdelen worden in dezelfde opstelling geplaatst, stevig tegen elkaar aangeduwd tot de gap-configuratie is bereikt, en vervolgens weer in contact geduwd terug naar de gap-configuratie.

We gaan nu één kam verwijderen. Vervolgens doorlopen we het proces van het verwijderen van de oude polystyreencoating, het reinigen van de chips, en het aanbrengen van een nieuwe polystyreencoating ter voorbereiding op de celkweek. Door de oude polystyreencoating te verwijderen en een nieuwe laag aan te brengen, zorgen we er opnieuw voor dat er geen resten van het vorige experiment interfereren met een nieuw experiment.

Nadat u het experiment heeft voltooid, is de eerste stap het bleken van de cellen, gevolgd door het afspoelen van de kammen met water. Zorg ervoor dat de chips volledig droog zijn voordat u ze in de tube plaatst. Hier hebben we een paar kammen die ik een tijdje heb laten luchtdrogen en ik controleer of ze volledig droog zijn.

We gaan nu een hoeveelheid toluene nemen en deze in deze glazen beker overbrengen. Hiervoor gebruiken we een glazen pipet om oplossen te voorkomen. Toluene lost plastic op, waardoor we geen typische polystyreen pipet kunnen gebruiken.

Oké, dat is ongeveer voldoende. Nu nemen we een paar van deze onderdelen, plaatsen ze in het tolueen, en ik zal de shaker inschakelen om te agiteren; we dekken het af met aluminiumfolie om te voorkomen dat het tolueen verdampt. Na twee uur zou het tolueen het grootste deel van het polystyreen op de kammen moeten hebben opgelost, waarna we ze er simpelweg uit kunnen halen en de kammen aan de lucht kunnen laten drogen.

Na de Halloween-spoeling moeten de onderdelen relatief vrij zijn van polystyreen en relatief schoon zijn. De onderdelen moeten echter extreem schoon zijn, zodat de nieuwe laag polystyreen een goede hechting vormt; als ze niet extreem schoon zijn, heeft het polystyreen de neiging om halverwege het experiment los te laten wanneer de cellen eraan gaan trekken.

Wat we nu gaan doen is een reiniging met piranha-oplossing. Ik heb de onderdelen in een glazen beker geplaatst en we gaan dit verhitten. We plaatsen het daarom op een warmteplaat.

En hier hebben we zwavelzuur en waterstofperoxide. Ik ga eerst het zwavelzuur inschenken en hierbij erop letten dat alle chips volledig onder de vloeistof zijn ondergedompeld. Soms hebben ze de neiging om te drijven.

Aangezien we nu met behoorlijk corrosieve chemicaliën werken, moet u ervoor zorgen dat u de juiste beschermende uitrusting draagt. Hier draag ik nitrilhandschoenen. We gaan nu de waterstofperoxide bij het zuur gieten; wees hierbij voorzichtig, want het is een exotherme reactie.

Zoals u kunt zien, rookt het een beetje tijdens de reactie, maar we willen wat energie aan het systeem toevoegen om het nog reactiever te maken. Daarom gaan we het nu verhitten tot 120 °C; het is nu ongeveer 120 °C, dus u kunt er zeker van zijn dat alle resten van uw celcultuur volledig van uw chips worden verwijderd. Op dit punt laat u de reactie gewoon volledig doorlopen totdat alle waterstofperoxide is verbruikt.

Op dat moment zal het mengsel stoppen met bubbelen. De reactie doet er ongeveer een half uur over om voltooid te worden. Zodra u geen bellen meer ziet, kunt u de warmteplaat uitschakelen en het mengsel laten afkoelen.

Vervolgens brengen we ze over naar het BAK-curve-water. Zorg hier opnieuw dat u Teflon pincetten gebruikt, geen metalen, en u kunt ze gewoon oppakken en overzetten. Nu spoelen we ze af onder een gestage stroom DDH₂O. Meestal neem ik dit rechtstreeks uit de hoofdlijn en laten we het hier minstens 10 minuten lopen.

Door dit te doen, spoelen we alle resten zuur na het vermalen 10 minuten lang af onder een waterstraal. Het zuur moet volledig uit de chips zijn verwijderd, waarna we ze onder water bewaren tot het moment dat we klaar zijn om het polystyreen te coaten; we gebruiken polystyreen met een molecuulgewicht van 45.000 van Sigma. Hier wegen we een kleine hoeveelheid hiervan af.

We hebben 400 mg die we gaan oplossen in tolueen met een concentratie van 100 mg/mL. Tolueen moet daarom in de zuurkast worden gehanteerd. Daarnaast moeten we, omdat we tolueen gebruiken om polystyreen op te lossen, ervoor zorgen dat we geen laboratoriummateriaal gebruiken dat van polystyreen is gemaakt.

Hier maken we gebruik van een conische polypropyleen buis en een glazen pipette. Omdat ik 400 milligrams polystyreen heb, voeg ik vier milliliters tolueen toe. Vervolgens vortexen we dit een half uur lang totdat het polystyreen is opgelost. We vortexen de buis nu op de laagste snelheid gedurende ongeveer 20 minuten tot een half uur.

Ik ga de buis nu aan de vortex bevestigen. Het is niet nodig om deze de hele tijd vast te houden. Na 20 tot 30 minuten zou het polystyreen opgelost moeten zijn en kunnen we beginnen met het coaten.

Nu gaan we het polystyreen in onze faciliteit spin-coaten. Onze spin-coater bevindt zich in een cleanroom. Daarom moeten we hier een kapje, een veiligheidsbril, een jas, overschoenen en handschoenen dragen, maar dat kan in uw faciliteit anders zijn.

Voordat we dit spanstuk gebruiken, wil ik het beschermen tegen het polystyreen. Daarom gaan we het bedekken met aluminiumfolie, waarbij we dit zo plat mogelijk tegen het oppervlak aan willen krijgen, zodat de chip vlak op het oppervlak kan liggen. We maken een klein gaatje precies in het midden, zodat we het vacuüm op de chip kunnen behouden.

De centrifugesnelheid is ingesteld op 2.400 RPM en 30 seconden. We kunnen nu een van onze chips pakken en deze zo plaatsen dat het midden van de chip het gat afdekt; ik laat het vacuüm eerst uitgeschakeld wanneer ik het polystyreen aanbreng, schakel vervolgens het vacuüm in en start dan de centrifugatie. Voor de kleinere onderdelen kunnen we iets minder dan 10 druppels aanbrengen.

Voor de grotere delen zijn iets meer dan 10 druppels polystyreen nodig. We centrifugeren dit gedurende 30 seconden bij 2.400 RPM. Vervolgens plaatsen we de met polystyreen gecoate chips in de oven bij 120 °C. Dit ligt boven het glastransitiepunt van het polystyreen.

Hierdoor zal het oppervlak opnieuw smelten om het iets gladder te maken, en het plastic zal ook verdichten en uitharden. Daarom laat ik het meestal een nacht in de oven staan. Het duurt waarschijnlijk ten minste een paar uur voordat het proces is voltooid.

Na het overnacht bakken zijn de chips klaar voor de plasmabehandeling. We stellen het polystyreen nu bloot aan een zuurstofplasma, wat de oppervlakte-energie zal veranderen zodat eiwitten en cellen er beter aan hechten. We plaatsen de chips in de plasmakamer en pompen deze vervolgens af tot een vacuüm.

Een goede instelling is 200 mTorr vacuüm en 200 watt vermogen gedurende één minuut onder een stroom zuurstofgas. Nu het systeem is vacuümgetrokken, gaan we de zuurstof introduceren. Oké, nu kunnen we het RF-vermogen inschakelen en het plasma gedurende één minuut ontsteken.

Wanneer het plasma actief is, geeft het daadwerkelijk licht. Het lijkt op een fluorescerende lamp. Na één minuut plasma-blootstelling brengen we de druk terug naar atmosferisch niveau en kunnen we de onderdelen eruit halen.

Nu zijn de onderdelen klaar voor de proteïncoating en het toevoegen van cellen. Het doel bij het ontwerpen van dit apparaat was om de microarchitectuur van weefsel op een dynamische manier te kunnen manipuleren. De micro-organisatie van weefsel in het lichaam, specifiek de positionering van de cellen ten opzichte van elkaar, is namelijk zeer bepalend voor de functie van elke individuele cel in een laboratoriumcultuur.

Tot voor kort waren we er niet in geslaagd dit goed te reproduceren, maar in de afgelopen vijf tot 10 jaar zijn onderzoekers in staat geraakt om cellen via micropatterning op een weefselkweeksubstraat aan te brengen, waardoor cellen precies op de gewenste positie in een weefselkweekplaat kunnen worden geplaatst. Hierdoor zijn enkele belangrijke aspecten van de basisbiologie van cel-celinteracties op microschaal ontdekt. Wat we tot nu toe echter nog niet hebben kunnen realiseren, is om dit proces dynamisch uit te voeren.

Dat houdt in dat de organisatie van een celcultuur tijdens het experiment wordt gewijzigd. Dit is belangrijk omdat weefsel in het lichaam geen statische omgeving is. Er zijn cellen die bewegen en zich reorganiseren, met name bij wondgenezing of ontwikkeling.

Maar zelfs in een normaal orgaan in homeostase is er veel activiteit. Het meest uitdagende technische aspect om te leren is simpelweg hoe je de onderdelen fysiek hanteert. Wanneer je begint met het werken met het systeem, kun je geïntimideerd raken door hoe fragiel de onderdelen zijn of hoe klein de bewegingen zijn die je moet maken.

Maar ik denk dat als u er gewoon een tijdje mee oefent, u er niet teveel moeite mee zult hebben. Op sommige plekken waar we zien dat dit apparaat een rol speelt, bijvoorbeeld bij de embryonale ontwikkeling, komen cellen in contact met een reeks verschillende celomgevingen terwijl de cellen door diverse embryonale lagen groeien. En het is bekend dat de interacties met elk van de lagen, naarmate ze er opeenvolgend contact mee maken, ons verder sturen langs een specifiek differentiatiepad.

Daarom denken we dat dit type apparaat geschikt kan zijn om dit soort gebeurtenissen in het laboratorium te reproduceren. Een van de aspecten van micro-organisatie die we specifiek wilden onderzoeken, was het verschil tussen cellen die communiceren via contactinteracties, waarbij de celmembranen elkaar kunnen raken, tegenover oplosbare factoren die worden uitgescheiden in het omringende medium en diffunderen naar een cel die zich iets verderop bevindt. Wanneer cellen in co-cultuur zijn en elkaar beïnvloeden, is het vaak onduidelijk of dit wordt veroorzaakt door contactinteracties of door uitgescheiden factoren.