Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay

Het algemene doel van deze procedure is om een Gus-reportersysteem te gebruiken om de potentiële dodelijke eigenschappen van specifieke genen te analyseren. Genen van belang worden gekloond in een Gus-cassette en gekweekt in de geschikte agrobacterium-vectoren onder een 35 s-promotor. Deze vectoren worden vervolgens getransformeerd in Agrobacterium-stam LBA 44 0 4 en gemengd met een cultuur die een Gus-expressiecassette bevat om bladeren van Nick Oceana Hamana te infiltreren.

Gus-activiteit kan visueel worden beoordeeld via histochemische kleuring, of kwantitatief via een fluorimetrische assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals DNA-laddering of de tunnel-assay, die veel worden gebruikt in zoogdiersystemen maar moeilijk te reproduceren zijn in planten, is dat dit een gevoelige, snelle transitie-assay op basis van planten is die gebruikmaakt van het eenvoudige feit dat levende cellen vereist zijn voor de expressie van gas. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Hua RAOs.

Een postdoctorale onderzoeker in ons laboratorium voor infiltratie heeft volledig ontplooide, gezonde bladeren nodig van drie tot zes weken oude Nicotiana hamana-planten, gekweekt bij 25 °C. Plan uit om dit protocol over acht dagen uit te voeren. Strijk op dag één glycerolstocks van Agrobacterium tumefaciens die de vectoren voor de celdood-assay en de vector met de Gus-expressiecassette bevatten uit op agarplaten; neem altijd een lege vector op als negatieve controle of stuffer wanneer meerdere cultuurcombinaties worden getest.

Incubeer de platen gedurende twee dagen bij 28 °C. Inoculeer op de derde dag twee milliliters selectief LB met een enkele kolonie van elke plaat. Incubeer elke cultuur onder schudcondities bij 28 °C gedurende 24 uur bij 200 RPM totdat de maximale groeidichtheid is bereikt.

Na 24 uur incubatie wordt de cultuur volledig geresuspendeerd door te pipetteren indien er klontjes aanwezig zijn, en wordt het totale volume voor elke cultuur aangevuld tot 10 milliliters met verse selectieve LB om de virulentiegenen van Agrobacterium te induceren. Voeg aceton toe tot een concentratie van 25 micromolar en incubeer elke cultuur onder schudomstandigheden bij 28 degrees Celsius gedurende nog eens 16 uur. De volgende stap is om elke cultuur te centrifugeren bij 4, 000 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en de pellet te resuspenderen in 10 milliliters infiltratiemedium.

Voeg geen aceton toe, centrifugeer de culturen opnieuw, maar resuspendeer ze nu. Suspendeer elk pellet in vijf milliliter infiltratiemedium dat 100 micromolar aceton bevat. Meet nu de OD bij 600 nanometer.

Concentraties tot 0,1 zijn acceptabel, maar als deze groter zijn dan 0,9, verdun dan tot 0,9 met infiltratiemedium en aceton vóór de infiltratie. Incubeer de culturen na de incubatie nogmaals gedurende drie uur bij 28 °C onder schudding. Meng de experimentele culturen en controleculturen in een verhouding van één-op-één met de cultuur die de Gus-cassette bevat.

Gebruik voor elke cultuur een naaldloze spuit van één milliliter om de ABA-afdichting of de onderkant van nieuw ontluikende bladeren te infiltreren. Het infiltratievolume is niet van belang. Wanneer er voldoende is toegevoegd zodat er een waterverzadigd gebied ontstaat, infiltreert u zowel de negatieve controle als het te analyseren gen op tegenoverliggende bladeren van dezelfde plant, en infiltreert u vervolgens twee andere planten op dezelfde wijze.

Er zijn dus planten in triplicaat voor elke cultuur. Drie dagen na infiltratie is het tijd om de bladeren te oogsten en de expressie van het gust-eiwit te analyseren. Begin de histochemische analyse door het volledige blad vacuüm te infiltreren met xlu-substraat totdat het volledig verzadigd is.

Incubeer de bladeren nu in het donker bij kamertemperatuur gedurende de nacht of totdat er een duidelijke blauwe kleuring zichtbaar is. Spoel de bladeren af met gedestilleerd water en incubeer ze gedurende de nacht in 70% ethanol totdat het chlorofyl is verwijderd. Spoel de bladeren de volgende dag af met gedestilleerd water en beoordeel de GUS-expressieniveaus.

Om de Gus-expressie te kwantificeren, wordt een substraat mug omgezet in een fluorescent product mu, dat gemeten kan worden; begin met het vermalen van geïnfiltreerde bladerijschijfjes in een vijzel met behulp van vloeibare stikstof. Voeg vervolgens 100 µL GUS-extractiebuffer toe terwijl de monster op ijs wordt bewaard. Centrifugeer de suspensie nu 5 minuten bij 14.000 ×g bij 4 °C en verzamel het supernatant dat de totale oplosbare eiwitten bevat, waaronder Gus.

Meet de totale oplosbare eiwitconcentratie met een NanoDrop en pas de concentratie aan naar 100 micrograms totaal eiwit per monster in Gus-extractiebuffer. Voeg vervolgens mug-substraat in Gus-extractiebuffer toe aan elk monster tot een eindconcentratie van twee millimolar mug. Een totaal volume van 100 microliters per monster moet voldoende zijn; meng door middel van pipetteren en incubeer de reactie gedurende een uur bij 37 degrees Celsius.

Stop de reactie na een uur door 800 µL GUS stopbuffer toe te voegen. Om de GUS-activiteit te kwantificeren, wordt 100 µL van elk monster op een microtiterplaat geladen, die in een platenlezer wordt geanalyseerd. Er wordt fluorescentie gemeten bij een excitatiegolflengte van 365 nm en een emissiegolflengte van 455 nm, waarna dit wordt vergeleken met een standaardcurve. De GUS-activiteit kan vervolgens worden gerapporteerd als MUnits GUS per µg totaal oplosbaar eiwit per minuut reactie. Afhankelijk van het gebruikte construct worden verschillende GUS-niveaus gedetecteerd wanneer de GUS-expressiecassette wordt co-geïnfiltreerd met een negatieve regulator van celdood of een anti-death gen.

Ter vergelijking worden hoge Gus-niveaus waargenomen. Gus-niveaus in de lege vectorkontrole zijn veel lager. Omgekeerd wordt, wanneer een positieve regulator van celdood of een pro-death-gen wordt gebruikt, een aanzienlijke afname in Gus-expressie waargenomen in vergelijking met de lege vectorkontrole.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer één week worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze techniek wordt gebruikt als een eerste stap om het potentieel van specifieke genen te bepalen. Er is aanvullend werk nodig om deze initiële resultaten te bevestigen en om het type cel dat daarbij betrokken is te bepalen.