Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Het onderhoud van epitheelaweefsels vereist de continue verwijdering van beschadigde en stervende cellen zonder de barrièrefunctie te verstoren. Om dit te bereiken, stoten epitheeltcellen stervende cellen uit door een ring van actine en myosine te vormen en samen te trekken in de cellen rondom de stervende cel, om deze uit te stoten terwijl eventuele openingen die door dit vertrek zijn ontstaan, worden gesloten. In dit video-artikel wordt een methode gepresenteerd om apoptotische cel-extrusie uit de epidermis van zebravislarven in realtime te induceren en te beelden.

In dit voorbeeld wordt dit bereikt door injectie van een met een rood fluorescent eiwit gelabelde F-actine-probe in ééncelstadium transgene zebravissenembryo's die groen fluorescent eiwit in de epidermis tot expressie brengen, om actinefilamenten in epitheelweefsels te visualiseren. Larven van vier dagen na bevruchting die zowel GFP als RFP tot expressie brengen, worden vervolgens behandeld met G418 om apoptose in de epidermis te induceren. Actinedynamiek en veranderingen in de vorm van epitheelcellen die tijdens extrusie optreden, worden gevisualiseerd door time-lapse-imaging op een spinning disc confocale microscoop.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immuno-krachtanalyses, is dat we snelle veranderingen en actinedynamiek kunnen observeren die optreden tijdens het extrusieproces in levend epitheelweefsel. In deze video laten we u een procedure zien voor het in real-time in beeld brengen van de extrusie van apoptotische cellen uit de epidermis van zich ontwikkelende zebravisjes. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te begrijpen hoe cellen hun actinecytoskelet gecoördineerd reorganiseren om apoptotische cellen te verwijderen terwijl de barrièrefunctie behouden blijft, en hoe het verstoren van dit extrusieproces kan leiden tot bepaalde ziektebeelden.

Laten we beginnen. Om de actinedynamiek tijdens celextrusie in de epidermis van zich ontwikkelende zebravissen te visualiseren, begint u met het ontdooien van eerder getranscribeerd RNA op ijs. We transcriberen mRNA dat codeert voor een rood fluorescent eiwit gefuseerd aan het calponin-homologiedomein van utrophine en een actinebindend eiwit. Voeg fenolrood toe aan het RNA in een verhouding van één-op-één voor een uiteindelijke RNA-concentratie van ongeveer 30 ng/µL en breng één µL van de oplossing aan in een getrokken capillaire naald door middel van back-filling.

Verzamel ongeveer 75 embryo's in het 1-celstadium van C-K-G-F-P in E three-buffer. Pipetteer de verzamelde embryo's met een 5,75 pasta-pipet in de micro-injectievorm en oriënteer de embryo's voorzichtig in de goot met een Dumont nummer 5 pincet. Werk snel om te voorkomen dat het RNA in embryo's in verschillende stadia moet worden geïnjecteerd onder een standaard laboratoriumdissectiestereomicroscoop.

Gebruik een drukgestuurde micro-injector om het RNA in de dooier van de embryo's te injecteren als fenolfossiel. Rood moet zichtbaar zijn in het embryo na injectie. Zorg ervoor dat er voor elk experiment ten minste 50 embryo's worden geïnjecteerd.

Sorteer de embryo's om onbevruchte of beschadigde eitjes te verwijderen en incubeer alle overgebleven embryo's bij 28 °C. Gebruik na 24 uur een fluorescent dissectiemicroscoop om zebravisembryo's te selecteren die een hoog niveau van GFP-fluorescentie in de epidermis en RFP-gelabelde actinefluorescentie vertonen. Incubeer de geselecteerde embryo's bij 28 °C totdat ze klaar zijn voor de behandeling met het geneesmiddel om apoptose te induceren door blootstelling aan het aminoglycoside.

Antibiotic G 418 of het geneesmiddel veroorzaakt extrusie van apoptotische cellen uit de epidermis van de ontwikkelende zebravislarven. Belangrijk is dat deze behandeling alleen werkt bij larven die vier dagen na bevruchting en ouder zijn om celextrusie te induceren. Verzamel maximaal 25 zebravislarven van 4 dagen na bevruchting die zowel GFP als RFP tot expressie brengen in een kweekschaal van 35 bij 10 millimeter met drie milliliter E 3 medium.

Vervang het medium voorzichtig door drie milliliter E drie met een concentratie van één milligram per milliliter G four 18 en incubeer de larven gedurende vier uur in het middel in het donker bij 28 °C. Verwijder vervolgens het medium en vervang dit door voorverwarmd E drie medium met 0,02% trica en ga verder met het monteren van de larven voor beeldvorming. Breng maximaal drie larven over naar een 1,5 milliliter fendor-buisje en verwijder het grootste deel van het E drie medium.

Pipette met een afgeknipt pipetteertip 120 µL 1% low melt agarose in de buis en meng dit. Pipetteer vervolgens voorzichtig de larven en het agarosemengsel op het dekglas onderin een Matech kweekschaal. Gebruik een FST-pinhouder met een ingezette pin of een aangebrachte wolfraamnaald om de larven snel zo te positioneren dat ze recht en plat tegen het dekglas liggen.

Laat de agarose stollen. Vul de schaal vervolgens voorzichtig met E3-medium dat 0,02% trica bevat. We hebben vastgesteld dat het gehele proces van extrusie van apoptotische cellen uit de epidermis van de ontwikkelende zebravislarven ongeveer 20 minuten duurt.

Hier demonstreeren we hoe u een time-lapse imaging-experiment opzet met behulp van een spinning disc confocale microscoop en de and or IQ-software om een serie Z-vlakken door een enkele laag van de epidermis van de zebravis te verzamelen. Zet eerst de argon- en heliumneonlasers, de microscoopcamera en de epifluorescentielamp in via de and or IQ-software. Maak een tijdreeks-protocol aan met de golflengten die moeten worden afgebeeld.

De frequentie van de intervallen tussen de beeldopnames en het aantal keren dat de opname moet worden herhaald. Plaats de mattec-schaal met het specimen voorzichtig op de microscooptafel en gebruik vervolgens een 20-voudige objectief met doorvallicht om op de larven te focussen. Draai het 40-voudige waterimmersie-objectief in de juiste positie. Met dit objectief kunnen we ongeveer 20 tot 25 cellen per gezichtsveld filmen, waardoor we het cellulaire gedrag tijdens extrusie kunnen volgen, terwijl we tegelijkertijd subcellulaire actinedynamiek kunnen onderscheiden.

Plaats voorzichtig een druppel water op de bovenkant van het 40-voudige objectief en plaats vervolgens snel de Mattec-schaal erbovenop. Identificeer het specimen met behulp van brightfield-verlichting en gebruik daarna 488 nanometer epi-fluorescentie om specifiek op de GFP-positieve epidermis te focussen. Schakel over naar de confocale scanmodus.

Pas de laserintensiteit en de belichtingstijd voor elk van de kanalen dienovereenkomstig aan. Let erop dat de lasersterkte en de belichtingstijd in balans zijn voor een optimale detectie van uw signaal en om fototoxiciteit te voorkomen. Om extruderende cellen te identificeren, gebruikt u epifluorescentie om de GFP-gelabelde epidermis te visualiseren en identificeert u een groep cellen in een klassiek rozetpatroon, bestaande uit een verzameling cellen die een kleine ronde cel in het midden omringen.

Daarnaast zou er een ophoping van het met RFP gelabelde actine zichtbaar moeten zijn als een ring rond de kleine ronde cel in het midden, wat kenmerkend is voor cel-extrusie. Zodra een extruderende cel is geïdentificeerd, moeten de boven- en ondergrenzen voor de Z-serie en de stapgrootte snel worden ingesteld. Begin vervolgens met het verkrijgen van vier 4D-confocale datasets om de gegevens te bekijken en de contractie van de actinering en het epitheliale gedrag rondom de stervende cel te visualiseren.

Maak na verloop van tijd 3D-projecties van de Z-serie en sla de gegevens op als een moviebestand. Deze stap kan worden uitgevoerd met behulp van diverse softwarepakketten. Deze figuur toont de expressie van RFP UTR CH in de epidermis van zebrafish-larven vier dagen na bevruchting met CK GFP.

Hier zijn still-frame Z-projecties uit een time-lapse movie die live actinedynamiek volgen. Tijdens het proces van epitheliale cel-extrusie geven de pijlen de ring van actine aan die is gevormd door naburige cellen, welke samentrekt en sluit gedurende een periode van twee minuten. Na deze procedure kunnen we andere methoden in combinatie met deze techniek gebruiken, zoals het gebruik van chemische inhibitoren of genetische mutaties, om beter te begrijpen hoe het wijzigen van extrusie kan leiden tot bepaalde ziektebeelden.

Voortbouwend op het onvermogen om apoptotische cellen te klaren, hebben we zojuist laten zien hoe u een time-lapse-imagingexperiment opzet om het extrusieproces uit de epidermis van de ontwikkelende zebravis te visualiseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de hoeveelheid licht die aan uw specimen wordt blootgesteld te beperken om fotobleking of toxiciteit te voorkomen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.