Karakterisering van de geïsoleerde, geventileerde en Instrumented Mouse Lung geperfuseerd met pulsatiele flow

Om de relaties tussen pulserende pulmonale druk en flow te bestuderen. Dit protocol legt uit hoe muizenlongen kunnen worden geïsoleerd, geventileerd en geperfuseerd. De trachea wordt chirurgisch blootgelegd voor ventilatie.

Vervolgens worden het hart en de longen geïsoleerd, zodat de arteria pulmonalis en het linker atrium gecannuleerd kunnen worden. Het longstelsel wordt daarna geperfuseerd. Experimenten worden uitgevoerd door de stroom in de arteria pulmonalis, de amplitude, de golfvorm en/of de frequentie te variëren.

De resulterende golfvormen van de longslagader- en linkerboezemdruk worden geregistreerd en tonen de pulsatiele relaties tussen longdruk en flow aan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vivo preparaties, is dat pulsatiele druk-flowrelaties kunnen worden verkregen zonder beïnvloeding door veranderingen in de volumestatus, de tonus van het sympathisch zenuwstelsel, activiteit en de effecten van anesthesie.

Bovendien meten de meeste geïsoleerde longpreparaten alleen stationaire druk-stroomrelaties, terwijl onze techniek het mogelijk maakt om pulsatiele druk-stroomrelaties te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de pulmonale fysiologie, zoals hoe pulmonale vaatziekten de pulsatiele pulmonale hemodynamiek beïnvloeden, of hoe verstijving van de grote longslagader de afterload van de rechterventrikel beïnvloedt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het blootleggen van het hart en de longen en het fixeren van de canule in de arteria pulmonalis moeilijk aan te leren is.

Overmatige druk door de instrumentatie kan longoedeem veroorzaken en een onjuiste plaatsing van de canule kan de longslagader perforeren. Voordat het experiment wordt gestart, is het noodzakelijk om het IL-one systeem voor te bereiden dat wordt gebruikt om de geïsoleerde long te ventileren en te perfunderen. De slangen moeten worden aangesloten op de druktransducers.

Spoel het systeem met een enkele pomp en debietmeter volledig door met gedestilleerd water dat is opgewarmd tot 37 °C en verwijder alle luchtbellen in de slang. Prime vervolgens de Endur tech pompslang met 1% PBS. Nul nu het systeem.

De druk voor elke P 75-transducer wordt bepaald door eerst de klep naar het IL-systeem te sluiten en de klep naar de atmosfeer te openen. Gebruik vervolgens de plug SIS-versterker om de druk automatisch op nul te stellen voordat het dier wordt voorbereid; bevochtig de IO-opstelling door het poreuze keramische onderdeel in gedestilleerd water te weken. Stabiliseer de muis na het toedienen van anesthesie voor de chirurgische ingreep door de voorpoten op een kurkbord vast te pinnen.

Spray nu de borstkas in met 95% alcohol. Gebruik een rechte pincet om de huid bij de nek vast te pakken en maak met de rechte schaar een opening van één centimeter. Zodra de binnenkant van de nek is blootgelegd, verwijdert u het witte klierweefsel in de oppervlakkige spieren terwijl u zoekt naar de slokdarm en de luchtpijp.

Isoleer de slokdarm en luchtpijp door het weefsel aan beide zijden en aan de achterzijde te verwijderen en bind een losse hechting rond de luchtpijp. Om de luchtpijp te cannuleren, knipt u voorzichtig met een kleine schaar een kleine V-vormige inkeping in één zijde ervan. Breng de muis nu met stompe pincetten naar het IL one-systeem.

Pak de trachealkanule en schuif deze in de trachea. Zet de kanule vast met een hechting. Begin eerst met ventilatie met omgevingslucht, bespuit de borstkas met alcohol en verwijder de huid met een rechte pincet en een rechte schaar.

Snijd de huid omhoog langs het borstbeen. Til de huid aan beide zijden op en snijd langs de lijn van de onderste ribben. Pak nu het xiphoïd-proces vast met een pincet en gebruik stomp schaare om een gaatje in het middenrif te knippen waar dit het onderste deel van het borstbeen raakt.

Pak het diafragma vast en snijd het los van de ribben. Pak met stompknip scharen het xiphoïde proces opnieuw vast en gebruik de stompknip scharen om voorzichtig het sternum door de ribben heen naar boven open te knippen, zonder de longen, het hart of de bloedvaten te beschadigen. Om het hart bloot te leggen, pakt u de linkerribben vast en knipt u de uiteinden eraf.

Injecteer nu langzaam 0,1 milliliters heparine in de rechterventrikel. Snijd na de injectie de rest van de ribben weg. Gebruik de achterkant of het ronde uiteinde van de pincet om de longen voorzichtig van de ribben weg te duwen terwijl de ribben onder een microscoop worden doorgesneden. Verwijder klierweefsel in het vet boven op het hart.

Gebruik de pincet om de weefsels weg te trekken en weg te knippen. Gebruik de veerschaar om een hechting rond de aorta en de longslagader te plaatsen, terwijl het hart voorzichtig met stompe pincetten wordt ondersteund. Er zou weinig weerstand moeten zijn.

Knoop nu een losse hechting met een dubbele worp. Snijd vervolgens de onderbuik weg. Gebruik gebogen scharen om door de ribben en de ruggengraat te knippen.

Dit zal leiden tot een aanzienlijke bloedstroom. Gebruik een wattenstaafje om de bloeding te stelpen. Zodra de bloedstroom is gestopt, wordt het IL-systeem geprimed met 4 mL RPMI vanuit een spuit gevuld met 10 mL RPMI.

Het is raadzaam om dubbel te controleren of de slang geen luchtbubbels bevat. Cannuleer nu de rechterventrikel door een kleine inkeping bij de apex te maken en de canule in te brengen. Richt de canule naar beneden in de rechterventrikel om de arteria pulmonalis te bereiken. De tip van de sonde moet zichtbaar zijn door de bijna transparante wand van de arteria pulmonalis.

Knoop vervolgens de hechting aan rond de canule, de aorta en de longslagader om de linker ventrikel te canuleren. Maak een inkeping in de apex en voer de canule in, gericht omhoog naar het linker atrium. Er kan lichte druk nodig zijn om de klep te vinden, maar zodra deze is gevonden, zal de canule erdoorheen glijden en stevig vastzitten zonder hechting.

Infuse RPMI handmatig vanuit de spuit van 10 milliliter met een snelheid van 0,3 milliliter per minuut totdat er stroming zichtbaar is in de uitstroomslang. Indien er geen stroming is in de uitstroomslang, positioneer de canule van de linker ventrikel dan opnieuw. Als er echter geen stroming in de longen is, breek het experiment dan af, omdat de longslagader waarschijnlijk een lek vertoont.

Nu het hart volledig is gecannuleerd, verbindt u de spuit van 60 milliliter met het IL 1-systeem. Gebruik de pomp voor een constante stroom en infuseer het RPMI Perfuse 8 met een snelheid van 1 milliliter per minuut. Controleer op lekkages tijdens de initiële perfusie.

Perfuseer de longen geleidelijk nog twee minuten lang, waarbij de longen wit zullen worden. Voor studies naar pulserende stroming: stel eerst de zuigerverplaatsing van de enkele pomp in op de gewenste niveaus.

Stel vervolgens de constante stroomsnelheid in. Open nu het ventiel naar de osli-pomp en begin met het vastleggen van de gegevens vlak voordat het osli-stroomprofiel wordt uitgevoerd. Open na voltooiing het gegevensuitvoerbestand en zet de experimentele stroming uit, gebaseerd op de experimentele stromingen van de eerste proef.

Pas de plagerverplaatsing van de oscillerende pomp bij elke frequentie aan zodat de Q max de gewenste waarde bereikt. Houd de ventilatie op een constante druk. Sluit tijdens de gegevensverzameling voor de steady-flowproeven de klep naar de solitaire pomp en stel de steady-flowsnelheid in op het gewenste niveau. Start de gegevensregistratie en doorloop het steady-flowprotocol.

Verzamel gedurende ten minste 10 seconden gegevens bij elke stroomsnelheid tussen de proeven door. Zet de stroomsnelheid terug naar 0,5 milliliters per minute. Zorg ervoor dat de ventilatie tijdens de gegevensverzameling op een constante druk wordt gehouden.

Als proeven met een linkeratriumdruk van nul gewenst zijn, verwijder dan de uitstroomslangen tijdens het uitvoeren van de proeven. Let nauwgezet op de aanwezigheid van RPMI in de luchtwegslangen. RPMI mag de druktransducers van de luchtwegen niet bereiken, omdat deze anders beschadigd raken.

Hier zijn de resultaten van de perfusie bij een constante stroom, met de stroom Q in de bovenste rij en de resulterende druk in de longslagader en het linker atrium in de tweede rij onder diverse omstandigheden. In de eerste twee panelen namen de druk in het linker atrium toe en af met Q omdat de uitstroomslang geplaatst was; het eerste paneel toont de luchtdruk aan het einde van de inspiratie, en het tweede paneel toont de luchtdruk aan het einde van de expiratie. Vervolgens werd de slang verwijderd, zodat de druk in het linker atrium constant was en onafhankelijk van Q. Daarna werd de hoogte van de uitlaatslang handmatig aangepast, zodat de druk in het linker atrium hoger was.

Maar onafhankelijk van Q opnieuw, toont het eerste paneel de luchtdruk aan het einde van de inspiratie, de inspiratoire druk, en het tweede paneel toont de luchtdruk aan het einde van de expiratie, de expiratoire druk. De resulterende gestage relaties tussen de druk in de longslagader en de flow voor elk geval kunnen worden verkregen door de druk uit te zetten tegen de flow.

Hier zijn de resultaten van de pulsatiele flowperfusie, met flow Q in het bovenste paneel en de resulterende druk in de longslagader, het linker atrium en de lucht in het onderste paneel. Op basis van deze pulsatiele relaties tussen longdruk en flow kan de pulmonale vasculaire impedantie worden berekend, wat de totale nabelasting van de rechterventrikel weerspiegelt.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 20 tot 30 minuten worden uitgevoerd. Het is belangrijk om tijdens deze procedure rustig aan te doen en te ontspannen, zodat uw handen stabiel blijven. Zodra de longen adequaat zijn geperfuseerd, is het moeilijkste gedeelte voorbij.

Na deze procedure kunnen andere technieken worden uitgevoerd, zoals histologie of biochemische analyses op het longweefsel, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke moleculaire mechanismen verantwoordelijk zijn voor de waargenomen veranderingen in de pulsatiele druk-stroomrelaties in de longen. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van de longfysiologie om de rol van specifieke genen en eiwitten bij de ontwikkeling en progressie van pulmonale vasculaire aandoeningen te onderzoeken met behulp van genetisch gemodificeerde muizen.