Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Het doel van deze procedure is om het mitochondriale membraanpotentiaal en de niveaus van reactieve zuurstofsoorten in primaire corticale neuronen te bepalen met behulp van de fluorescerende probes TMRM en H 2D CFD respectievelijk. Dit wordt bereikt door eerst stamoplossingen en werkconcentraties van TMRM en H 2D CFDA voor te bereiden. De tweede stap is het incuberen van de corticale neuronen met TMRM en H 2D CFDA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in Thai roads-buffer.

De derde stap is het beelden van de fluorescentie-intensiteit van TMRM en DCF in levende corticale neuronen met respectievelijk 515/517 nanometer en 488/515 nanometer excitatie-emissie. De veranderingen in de TMRM-fluorescentie worden gemonitord in aanwezigheid van de mitochondriële ontkoppelaar FCCP, terwijl de veranderingen in de DCF-fluorescentie worden gemonitord in aanwezigheid van waterstofperoxide. De laatste stap van deze procedure is de verzameling, normalisatie en analyse van de gegevens.

Uiteindelijk worden de resultaten verkregen door een grafiek te plotten die de relatieve niveaus van TMRM- en DCF-fluorescentie-intensiteit respectievelijk voor en na behandeling met FCCP en waterstofperoxide weergeeft. Hallo, ik ben Joanna Koska. Welkom in mijn laboratorium aan de Loyola University Chicago.

Vandaag laten we u zien hoe u het mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstofcomponenten kunt meten in corticale neuronen van ratten. De procedure wordt gedemonstreerd door dhi. Hallo, ik ben de Denise Jossi.

Met deze procedure kan het mitochondriale membraanpotentieel worden gemeten met een enkelvoudige mitochondriale markering en reactieve zuurstofverbindingen met een enkelvoudige celmarkering. Laten we beginnen. Bereid een 10 millimolar stockoplossing van TMRM door vijf milligram TMRM op te lossen in één milliliter watervrij dimethylsulfoxide en één minuut te vortexen.

Maak vervolgens aliquots en bewaar deze bij -20 °C. Bescherm tegen licht en gebruik binnen één maand. Bereid daarna een 10 mM stockoplossing van H 2D CFDA door 4,87 mg H 2D CFDA op te lossen in 1 mL watervrije dimethylsulfoxide.

Vortex op dezelfde manier gedurende één minuut, maak vervolgens aliquots en bewaar deze bij -20 °C. Bescherm tegen licht en gebruik binnen één week om de rat corticale neuronen eerst te laden met TMRM. Was de gekweekte neuronen drie keer met tyro's buffer.

Bereid vervolgens 20 nM TMRM voor door de 10 mM TMRM-stock 1000 keer te verdunnen in tb. Voeg daarna twee µL van de verdunde TMRM toe per 1 mL tb. Incubeer de neuronen met TMRM gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Plaats na 45 minuten de kweekschaal op de tafel van de microscoop en start de beeldvorming om de ratte corticale neuronen te laden met H 2D CFDA, en was de gekweekte neuronen drie keer met tb. Bereid vervolgens twee micromolair H 2D CFDA voor door de 10 millimolair H 2D CFDA-stock 10 keer te verdunnen in tb. Voeg daarna twee microliter van de verdunde H 2D CFDA toe per ene milliliter tb.

Incubeer de neuronen vervolgens 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur met H 2D CFDA. Was de neuronen vier keer met TB om overtollige fluorescente indicator te verwijderen voordat er beelden worden vastgelegd om live-imaging uit te voeren van neuronen die zijn geïncubeerd met TMRM via confocale laserscanmicroscopie, waarbij een programma voor live-tijdreeksen wordt gebruikt. Pas een lage resolutie en gedempte lasersterkte toe om de tijd die nodig is voor het verkrijgen van beelden te minimaliseren en fotobleken te voorkomen.

Stel vervolgens de focus van de gemonteerde neuronen die geladen zijn met TMRM in met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de TMRM-fluorescentie door illuminatie bij 540 nanometers en detectie bij 570 nanometers. Stel de detectieversterking van de camera net onder het verzadigingsniveau in zodra alle parameters zijn ingesteld, waaronder de resolutie, het laservermogen, de detectie, de versterking van de camera en het time-lapse interval voor het verkrijgen van beelden.

Wijzig deze instellingen niet tussen experimenten door. Wijzig vervolgens het veld. Begin met het verzamelen van beelden om wijzigingen in de delta PSY M-stimulus te testen; zo kan bijvoorbeeld 1 µM FCCP of 2 µg/mL oligomycine worden toegepast, wat respectievelijk zal leiden tot een significante depolarisatie of hyperpolarisatie van het mitochondriale membraanpotentiaal.

Deze veranderingen zullen worden weerspiegeld door een afname in TMRM-fluorescentie-intensiteit vergeleken met de basislijn-fluorescentie-intensiteit in het geval van FCCP, of een toename in TMRM-fluorescentie-intensiteit. Om live-imaging uit te voeren van neuronen die eerst zijn geïncubeerd met H 2D CFDA, monteert u het kweekschaaltje op de tafel van een microscoop en stelt u de focus van de cellen in met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de DCF-fluorescentie door excitatie bij 4 88 nanometers en emissie bij vijf 15 nanometers.

Stel vervolgens het laservermogen in op 5 tot 7%, stel de gain in en kies een resolutie van 256 bij 256. Wijzig deze instellingen niet tussen de experimenten door. Stel daarna de frequentie in voor het verkrijgen van live-beelden.

Select met het Time series-programma een nieuw veld en start de beeldacquisitie om veranderingen in de R os-niveaus te detecteren. Behandel de cellen met 100 tot 200 µM waterstofperoxide. Dit zal resulteren in een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van het basisniveau.

Gebruik de tool voor het selecteren van het interessegebied (region of interest) van het LSM-programma om de gebieden te selecteren. Selecteer vervolgens ROI's van mitochondriale regio's of ROI's van het gehele cellichaam in de celafbeeldingen. Dit dient om respectievelijk de fluorescentie-intensiteiten van TMRM of ROS te meten.

Selecteer regio's naast de cellen. Voer meerdere metingen uit om de achtergrondfluorescentie-intensiteit te bepalen en trek, met behulp van Microsoft Excel, de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit af van de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de regio's van belang in elke cel voor elk tijdstip om de gemiddelde achtergrondintensiteit te berekenen. Normaliseer na aftrek van de achtergrondintensiteit de TMRM- of DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de baseline-fluorescentie.

Gebruik deze formule en gebruik vervolgens het Sigma plot-programma om de grafiek te genereren die de veranderingen in fluorescentie-intensiteit over de tijd weergeeft. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiebeeld van ratte corticale neuronen die zijn geïncubeerd met TMRM. De toevoeging van de mitochondriële ontkoppelaar F-C-C-P-A leidt tot mitochondriële depolarisatie en een verlies van TMRM-fluorescentie-intensiteit.

Het basisniveau van de TMRM-fluorescentie blijft stabiel vóór de toevoeging van FCCP. Kwantitatieve analyse van de veranderingen in TMRM-fluorescentie over de tijd laat een significante afname in TMRM-fluorescentie zien na toevoeging van FCCP. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiebeeld van corticale neuronen van raten die zijn geladen met DCF.

Het basisniveau van de DCF-fluorescentie blijft ongewijzigd gedurende de eerste 120 seconden voorafgaand aan de toevoeging van waterstofperoxide. De toevoeging van waterstofperoxide leidt tot een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit in de cellichamen. Time-lapse metingen van de DCF-fluorescentie tonen stabiele niveaus die zijn gestegen na de behandelingen met waterstofperoxide.

Bij deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een laag laservermogen en een hoge scansnelheid moeten worden gebruikt om artefacten door fotobleken en fototoxiciteit te voorkomen. Veel succes met uw experiment.