Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Het algemene doel van deze procedure is om het vermogen tot membraanherstel te beoordelen in zowel het dier als in geïsoleerde cellen. Geïsoleerde skeletspiervezels worden verzameld en omringd met medium dat FM 1 43-kleurstof bevat. Vervolgens wordt een UV-laser gebruikt om een deel van het celmembraan te bestralen en te beschadigen, zodat de kleurstof de cel kan binnendringen.

Geïsoleerde cellen worden getransfecteerd met plasmide-DNA dat GFP MG 53 tot expressie brengt, dat zal lokaliseren naar het plasmamembraan en het cytosol van de cel. De punt van een micro-elektrode wordt vervolgens in het C two C 12 membraan ingebracht om beschadiging te induceren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de translocatie van GFP MG 53 naar de beschadigingsplaats aantonen.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien er oefening nodig is om de technieken van micro-elektrodepenetratie en spiervezelisolatie onder de knie te krijgen. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Lin, onze labmanager, Dr. Wazu, postdoc-fellow Matt Orange, een promovendus, en Dr. Shaza, research assistant professor in onze afdeling. Plaats ter begin een dienblad of een blauwe laboratoriummat onder de loopband om afval van de dieren tijdens het experiment op te vangen.

Stel vervolgens de hoek van het loopbandoppervlak in. Sommige loopbanden hebben een geïntegreerd mechanisme om de helling aan te passen, terwijl andere loopbanden op een andere manier moeten worden verhoogd. Over het algemeen wordt een vlak oppervlak of een hoek tussen 7 en 15 graden bergafwaarts of bergafwaarts gebruikt.

Acclimateer de muizen door ze op de loopband te plaatsen met het elektrische rooster uit en de aandrijfmotor van de band aan, maar zonder beweging gedurende 15 minuten; schakel na de acclimatisatieperiode het motiverende elektrische rooster in. Start de loopband met een beginsnelheid van ongeveer vijf meter per minuut. Laat het dier een opwarmperiode van vijf minuten hebben, waarbij de snelheid elke minuut met één tot twee meter per minuut toeneemt.

Herhaal deze opwarmperiode elke dag gedurende drie tot 10 dagen om de compliantie tijdens het testen te verhogen. Om een acute uitputtingsinspanning uit te voeren, wordt de snelheid van de loopband geleidelijk verhoogd tot een maximale snelheid is bereikt, waarbij wordt gelet op tekenen van uitputting.

Een dier wordt als uitgeput beschouwd wanneer het meer dan de helft van de tijd van de loopband af is of vijf opeenvolgende seconden op het rooster verblijft. Verwijder de uitgeputte muis en noteer de totale looptijd. Uithoudingstraining.

Loopprotocollen beginnen met dezelfde warming-up procedure. Echter is de maximumsnelheid over het algemeen lager en kunnen de looptijden vrij lang zijn. Plaats de muizen na de test terug in hun thuiskooi en reinig de loopband met 70% ethanol.

Isoleer de oppervlakkige laag van de musculus flexor digitorum brevis van de voet voor verdere analyse. Snijd eerst de huid van de zool langs de mediane lijn, waarbij u er zorg voor draagt de onderliggende spier niet te beschadigen. Maak vervolgens horizontale incisies en verwijder de huid.

Identificeer de platte, witte pees van de FDB-spier die is vastgehecht aan het hielbeen (calcaneus). Gebruik een pincet om de pees te scheiden en snijd deze vervolgens door vlakbij de aanhechtingsplaats. Trek de pees voorzichtig omhoog terwijl u eventueel bindweefsel wegsnijdt.

Lokaliseer de plek waar de distale pezen vertakken naar de individuele vingers. Snijd de pezen door op het punt waar ze verbonden zijn met de diepere spierlaag en verwijder de FDB. Plaats de FDB-spierbundel in één milliliter collagenase-oplossing, voorverwarmd tot 37 °C.

Plak de buis horizontaal op een orbital shaker bij 37 °C en schud 65 minuten lang bij 200 RPM. Voldoende digestie wordt gekenmerkt door een fragiele verschijning en een bleke kleur. Knip het uiteinde van een pipetteerpunt van 1 mL af zodat het gedigesteerde bundeltje erdoorheen kan passeren.

Breng het bundeltje eenvoudig over in een centrifugebuis met ongeveer 600 µL 2.5. Calcium tyro. Keer de buis voorzichtig om om de losse vezels van het bundeltje te schudden.

Snijd vervolgens het uiteinde van een 30 µL pipetpunt af, zodat de diameter slechts iets kleiner is dan de spierbundel. Gebruik deze punt om de bundel in de pipet op te zuigen en duw deze vervolgens terug in de oplossing. Herhaal dit proces totdat het grootste deel van de vezels is gedissocieerd van de bundel.

Meng de gedisassocieerde vezels door de buis voorzichtig te draaien. Neem de gewenste hoeveelheid af en breng deze over op een glassbottom delta T-schaaltje. Bewaar de resterende vezels gedurende ongeveer zes uur bij vier graden Celsius voor gebruik en aanvullende studies.

Laat de schaal vijf minuten ongestoord staan. Hierdoor kunnen de vezels hechten aan de glazen bodem van de schaal. Plaats de schaal met glazen bodem op een confocale microscoop die is uitgerust met een UV-laser.

Observeer de vezels onder fasemicroscopie bij een vergroting groter dan 100 x om de aanwezigheid van een normaal striatiepatroon en een rechte, staafvormige vorm te controleren. Voeg FM 1 43 of FM 4 64 styro perineum-kleurstoffen toe aan de oplossing tot een eindconcentratie van 2.5 micromolar. Positioneer de vezel in een hoek van 45 graden van linksboven naar rechtsonder in het gezichtsveld om schade te induceren.

Bestraal een gebied van vijf bij vijf pixels van het plasmamembraan. Met een UV-laser ingesteld op maximaal vermogen gedurende vijf seconden moet de bestraalde regio het plasmamembraan splitsen, waarbij de helft van het vak van vijf bij vijf zich binnen de vezel moet bevinden en de rest buiten de vezel. Leg beelden vast van de instroom van kleurstof in de vezel met intervallen van vijf seconden gedurende maximaal vijf minuten. Er mogen slechts drie vezels per schaaltje worden bestraald, aangezien de fluorescerende kleurstof uiteindelijk door de vezel zal worden geendocyteerd, wat elke data-analyse kan bemoeilijken.

Nadat er drie vezels zijn gebruikt, dient er een nieuw schaaltje te worden klaargemaakt. Bereken met behulp van analyse-software de verandering in fluorescentie-intensiteit in een gebied van ongeveer 200 vierkante micron voor de vergelijking tussen vezels. De volgende berekening moet voor elk frame worden uitgevoerd: delta F gedeeld door F nul, waarbij F nul de gemiddelde fluorescentie van het geselecteerde gebied (region of interest) in het eerste vastgelegde frame is en delta F de verandering in fluorescentie in elk opeenvolgend frame is.

Gebruik standaardmethoden om cellen te transfecteren met plasmid DNA dat GFP MG 53 tot expressie brengt. Bereid vervolgens de micropipetten voor. Plaats een Pyrex-capillair op een micropipet.

Trek en trek volgens het vooraf ingestelde programma. Bevestig de micropipet aan een driasige micromanipulatorcultuur. Het medium wordt uit de delta T-schaal verwijderd en vervangen door 2,5 millimolar calciumtyro-buffer.

Plaats de schaal met getransfecteerde cellen op een laser-scanning confocale microscoop met een 40 x 1,3 NA olie-immersie-objectief. Induceer acute schade aan de levende cel door de micropipet in het celmembraan in te brengen en deze vervolgens snel uit de cel terug te trekken. Leg opeenvolgende beelden van de levende cel vast met een interval van 1,54 seconden per frame voor de door troponine geïnduceerde membraanruptuur.

PERFUSEER 0,005% troponine met een snelheid van ongeveer één milliliter per minuut direct boven de cel die wordt afgebeeld. De loopband kan worden gebruikt om een afname van het loopvermogen te meten. De MG 53-knockoutmuizen die hier worden getoond, hebben een verminderd loopvermogen als gevolg van schade aan de skeletspieren.

De mate van schade veroorzaakt door de UV-laser hangt af van het membraanherstelvermogen van de waargenomen vezel. Hier is een vezel vóór het letsel bij een normale muis. Deze afbeelding is 200 seconden later vastgelegd en toont een licht letsel.

Een spiervezel afgeleid van MG 53 knockout-muizen met een aangetast vermogen tot membraanherstel zal een significantere kleurstofintreding vertonen na een waargenomen beschadiging. Hier is een voorbeeld van een onbeschadigde GFP MG 53 getransfecteerde C2C12 myotube. De pijl in deze afbeelding wijst naar GFP MG 53-bevattende blaasjes die zich bewegen naar de plaatsen van beschadiging.

In dit voorbeeld werd saponine gebruikt om het plasmamembraan te beschadigen. Let op de translocatie van GFP MG 53 van het cytosol naar het celmembraan na de beschadiging. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om goede spiervezels te isoleren met gladde sarale membranen en duidelijke dwarsstreeppatronen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de capaciteit voor membraanherstel van spieren kunt beoordelen en hoe u de cellen kunt kweken.