A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Het doel van dit experiment is om 3D weefselachtige sferoïden te genereren. Dit wordt bereikt door eerst gecultureerde cellen te oogsten en vervolgens een suspensie van enkelvoudige cellen te maken. Vervolgens worden druppels van de celsuspensie aangebracht op de onderzijde van het omgekeerde deksel van een weefkweekschaal.

Vervolgens wordt het deksel omgekeerd op de hydratatiekamer geplaatst. De laatste stap is om de hangende druppels 24 tot 48 uur te incuberen, zodat aggregaten kunnen vormen. Deze kunnen vervolgens worden overgebracht naar een schuddend waterbad en tot vijf dagen langer worden geïncubeerd.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die verschillen in aggregaatcohesie of cel sortering aantonen via compactie-assays, weefseloppervlakte-symmetrie of epiflorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele 2D-weefselkweek, is dat cellen die in 3D zijn gekweekt de cellulaire interacties die cellen in een weefselomgeving ervaren, nauwkeuriger nabootsen. Ik zal deze methode demonstreren om aan te tonen dat deze zo eenvoudig is dat zelfs een PI het kan.

Om dit experiment te beginnen, oogst adhesioncellen bij een confluentie van 90%. Aspireer eerst het kweekmedium en spoel de cellaag twee keer met PBS. Aspireer vervolgens de PBS en pipetteer twee milliliters van een 0,05% trypsin-EDTA-oplossing op de monocultuurlaag.

Plaats de plaat in de weefselkweekincubator op 37 °C en incubeer totdat de cellen loslaten. Neem vervolgens de plaat uit de incubator en stop de enzymatische werking door twee milliliter compleet medium toe te voegen.

Gebruik een pipet van vijf milliliter om het mengsel te tritureren totdat de cellen volledig in suspensie zijn. Breng de celsuspensie vervolgens over in een conische buis van 15 milliliter. Pipetteer 40 µL van een DNA-oplossing van 10 mg/mL in de celsuspensie en incubeer dit gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur na de incubatie.

Vortex de celstuspensie kort en centrifugeer vervolgens bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt het S-supernatans afgezogen en weggegooid, waarna de pellet wordt geresuspendeerd in één milliliter compleet medium om te wassen. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de pellet in één milliliter compleet medium.

Voer vervolgens een celtelling uit met een automatische celteller of een hemocytometer. Pas de celsuspensie met medium aan tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 × 10⁶ cellen per milliliter. Ga daarna over tot de vorming van hangende druppels.

Bereid een hydratatiekamer voor door het deksel van een weefkweekschaal van 60 millimeter te verwijderen en vijf milliliters PBS in de bodem van de schaal te pipetteren. Keer het deksel van de schaal om en pipetteer tot 2010 microliter druppels cel-suspensie op de onderzijde van het deksel. Zorg ervoor dat de druppels voldoende uit elkaar worden geplaatst zodat ze elkaar niet raken.

Plaats het deksel met de druppelculturen voorzichtig terug op de bodem van de schaal met PBS. Plaats de cultuurplaat in een weefselkweekincubator. Stel deze in op 37 °C, 5% koolstofdioxide en 95% luchtvochtigheid en incubeer gedurende de nacht.

Controleer de druppels dagelijks en zet de incubatie voort totdat er cellagen of aggregaten zijn gevormd. Zodra cellagen of aggregaten zijn gevormd, worden deze overgebracht naar glazen kolfjes met een ronde bodem die drie milliliters compleet medium bevatten. Incubeer de kolfjes met de cellagen of aggregaten in een schuddend waterbad.

Houd dit gedurende ongeveer 24 uur op 37 °C en 5% koolstofdioxide, totdat de vorming van steroïden onder een dissectiemicroscoop zichtbaar is. Zodra de steroïden zijn gevormd, kan het effect van experimentele manipulaties op de steroïdevorming worden gekwantificeerd volgens de procedure die in het schriftelijke protocol is beschreven. Daarnaast kan de membraanintercalatie van eventuele eerder toegevoegde fluorescerende kleurstoffen nu worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Deze brightfield-microscoopafbeelding demonstreert de aggregatie van rat prostaatkanker MLL-cellen na 18 uur incubatie met behulp van de hanging drop-methode. Deze afbeelding toont een tweede aggregaat van MLL-cellen dat is gevormd na 18 uur cultuur met gebruik van de hanging drop-methode. Deze cellen werden gekweekt in de aanwezigheid van 25 micromolar van de MEK-remmer PD 9 8 0 5 9, wat resulteerde in een aanzienlijk compacter aggregaat van cellen.

Hier wordt het verschil in aggregaatgrootte aangetoond tussen een MLL hanging drop-cultuur behandeld met een MEK-remmer en een onbehandelde controleaggregaat. Het asteriskteken geeft een statistisch significant verschil aan van P kleiner dan 0,0001. Zoals bepaald door een student T-test tussen onbehandelde en met een MEK-remmer behandelde aggregaten, suggereert dit dat behandeling met een MEK-remmer resulteert in significant kleinere en compactere aggregaten.

Deze afbeelding is vastgelegd met een Nikon Smz 800 stereomicroscoop en illustreert een steroïde gevormd door het incuberen van embryonale levercellen van kuikens in een hangende-druppelcultuur gedurende 18 uur, gevolgd door 48 uur in een schuddend waterbad bij 37 °C. Deze confocale microscopische afbeelding demonstreert het sorteergedrag dat optreedt wanneer bepaalde celpopulaties samen worden gekweekt met de hangende-druppelmethode; voordat er werd overgegaan tot de hangende-druppelcultuur, werden de embryonale levercellen van kuikens gekleurd met pkh two membraan-intercoatingkleurstof en embryonale cellen van kuikens.

Hartcellen werden gekleurd met PKH 26. De cel-suspensies werden vervolgens gemengd en via de hanging drop-methode aangebracht. De cultuur werd gedurende 18 uur uitgevoerd, gevolgd door een incubatie van 48 uur in een schuddend waterbad bij 37 °C.

Uit de optische sectie is te zien dat de geelgekleurde hartcellen zijn omgeven door levercellen. Hier in het blauw pseudo-gekleurd, twee nardi- en getransfecteerde L-celklonen die NCA op hun oppervlakken tot expressie brengen. In een verhouding van 2,4 op één werden deze gekleurd met de fluorescerende membraan-intercalerende kleurstoffen PKH 2 en PKH 26, gemengd in gelijke proporties, en gekweekt als hangende druppels zoals eerder beschreven.

In dit voorbeeld zijn de cellen die veel e-cadherine tot expressie brengen, welke groen zijn gekleurd, omringd door cellen die lagere niveaus van e-cadherine tot expressie brengen, welke rood zijn gekleurd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 30 minuten of minder worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast.