Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om meerdere macrofaagculturen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van ratlevercellen, zonder dat hiervoor complexe apparatuur of vaardigheden nodig zijn. Dit wordt eerst bereikt door dissociatie van levercellen van volwassen ratten via collagenaseperfusie, gevolgd door isolatie van de parenchymale hepatocytcellenfractie. Vervolgens worden de cellen geïncubeerd in T 75 weefselkweekflessen met groeimedium om gemengde primaire culturen van levercellen te vestigen.

Na 10 tot 12 dagen kweken worden de kweekflessen geschud om de overdracht van de macrofagen naar plastic schaaltjes te vergemakkelijken, waarna ze na een korte incubatieperiode door selectieve adhesie worden geoogst. Uiteindelijk kunnen meer dan 10 van de zes cellen herhaaldelijk worden geoogst uit dezelfde T 75 weefselkweekflessen met intervallen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken. Isolatiemethoden voor levermacrofagen zijn uitvoerig beschreven.

De meeste eerdere methoden vereisen echter geavanceerde apparatuur, zoals een centrifuge, en verfijnde technische vaardigheden. Hier presenteren wij een eenvoudige en nieuwe methode om levermacrofagen in voldoende aantal en zuiverheid te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van adult gewrapte levercellen, waarvoor geen speciale apparatuur of geavanceerde laboratoriumvaardigheden nodig zijn. De dissectie van dieren, perfusie van de lever en preparatie van cyten zullen worden gedemonstreerd door doktoren Norco, Yamanaka en Miko yoshioka aan het National Institute of Animal Health.

Vervolgens zal dr. Taketo Takeno van het National Institute of Agro Biological Sciences de isolatie en zuivering van levermacrofagen uit culturele risico's demonstreren. Laten we beginnen. Om de perfusie van de rattenlever voor te bereiden, begint u met het voorverwarmen van één fles wasoplossing en één fles collagenase-oplossing.

Bevestig vervolgens de sedatie door middel van een huidknijptest, plaats een geanestheseerde volwassen mannelijke rat in een roestvrijstalen pan en spray 70% ethanol op de buik en thorax. Maak daarna met dissectiescharen een kleine incisie in het midden van de buik en pel de huid terug. Open vervolgens de buikholte met de schaar en bevestig de locatie van de vena portae.

Haal vervolgens de chirurgische hechtdraad onder de vena portae door en trek de draad losjes aan. Klem daarna het distale deel van de vena cava inferior en de vena mesenterica af met een mosquito-klem om bloedreflux naar de lever te voorkomen. Open de borgholte door het diafragma met een schaar door te snijden en leg het hart bloot; maak na het maken van een kleine incisie in de vena portae met oogheenscharen een plastic katheter van 2 mm in de vene in en trek de draad stevig rond de katheter aan.

Vul een perfusiesysteem met de voorverwarmde wasoplossing en sluit dit vervolgens aan op de katheter. Start de perfusie in C twee met een snelheid van 10 milliliters per minuut. Maak tegelijkertijd met dissectieschaar een incisie in de wand van het rechteratrium.

Zet de perfusie gedurende 10 minuten voort, schakel vervolgens de perfusie-oplossing over naar de collagenase-oplossing en perfuseer gedurende 10 tot 20 minuten. Vul een steriel bekerglas met 25 milliliters collagenase-oplossing bij een snelheid van 10 milliliters per minuut. Verwijder vervolgens de geperfuseerde lever en plaats deze voorzichtig in het bekerglas.

Hak de lever met een schaar in kleine stukjes. Voeg 75 milliliters koud MEM toe aan de resulterende celсусpensie. Filter de suspensie na voorzichtig pipetteren door een 100 micrometer cell strainer.

Om het bindweefsel in de onverteerde weefselfragmenten te verwijderen, wordt het filtraat opgevangen in conische buizen van 50 milliliter. Overbreng het filtraat naar conische buizen van 50 milliliter en was de cellen vier keer door de cellen eerst één minuut te centrifugeren bij 50 Gs bij vier graden Celsius. Terwijl de centrifuge tot stilstand komt, wordt het supernatant voorzichtig weggegooid, waarna het pellet opnieuw wordt geresuspendeerd in koud MEM; na de laatste wasbeurt worden de cellen opnieuw gecentrifugeerd.

Resuspendeer de levercellen in groeimedium. Zaai de cellen vervolgens uit in vijf tot 10 T 75 weefselkweekflessen met een dichtheid van 6,7 × 10⁴ cellen per vierkante centimeter. Plaats de kweekflessen in een incubator en vervang het groeimedium elke twee tot drie dagen.

Na één dag kweek verspreiden de parenchymale hepatocyten zich over het oppervlak van de fles en vertonen ze een typische polygonale, op copaalsteen lijkende morfologie met één of twee ronde kernen. Binnen enkele dagen kweek verliezen de parenchymale hepatocyten hun epitheliale celmorfologie en transformeren ze tot vlakkere fibroblastische cellen. Rond dag zes beginnen, bij fasecontrast, heldere ronde macrophage-achtige cellen te prolifereren op het vel fibroblastische cellen. De groei van de macrophage-achtige cellen bereikt rond dag 12 maximale niveaus.

Het aantal macrofaagachtige cellen neemt af rond dag 19, wanneer de fibroblastische cellaag begint te degenereren. Daarom suspenderen we na ongeveer zeven tot 10 dagen kweek de macrofagen die op de cellaag zijn geprolifereerd in het kweekmedium door de kweekflessen 30 minuten lang wederkerig te schudden nadat de macrofagen zijn geresuspendeerd. Vul elke plastic schaal van 100 millimeter (niet-weefselkweekkwaliteit) met het medium van twee T 75-flessen.

Vul de kweekflesjes opnieuw met groeimedium en plaats ze terug in de incubator. Incubeer de plastic schaaltjes gedurende 30 minuten na de incubatieperiode en was de schaaltjes drie keer door het medium af te zuigen en de plastic schaal voorzichtig te spoelen met PBS, zoals hier te zien is; reeds 10 minuten na het uitplaten zijn macrofaag-achtige cellen gehecht aan het oppervlak van de schaal, terwijl andere contaminerende fibroblastische cellen in suspensie blijven. Na het spoelen met PBS is een zeer gezuiverde populatie macrofagen verkregen.

Zoals in deze figuur te zien is, verkrijgen de cellen na 40 minuten kweek een typische macrofaagmorfologie en worden er regelmatig mitotische cellen waargenomen, zoals aangegeven door de pijlen. Om deze nieuwe, sterk gezuiverde populatie macrofagen te oogsten, voegt u één milliliter trip LE Express-oplossing toe aan de gewassen cellen en plaatst u de schaaltjes gedurende nog eens 10 minuten terug in de incubator. Voeg na deze incubatieperiode negen milliliter groeimedium toe, schraap vervolgens de aanhechtende macrofagen voorzichtig los met de celschraper, breng deze over naar een kegelvormige buis van 15 milliliter, centrifugeer en gooi het supernatant weg.

Voeg één milliliter van het groeimedium toe, dissocieer de resuspendeerde celklonters tot enkelvoudige cellen door krachtig te pipetteren, en bepaal het celgetal met een hemocytometer zoals weergegeven in deze grafiek; meer dan 10^6 cellen kunnen herhaaldelijk met intervallen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken worden geoogst uit een T 75-kweekfles, wat een totale celopbrengst van 10^7 per T 75-kweekfles mogelijk maakt. Zoals te zien is in deze afbeeldingen, zijn de geïsoleerde cellen immunogekleurd met monoklonale antilichamen tegen rattenmacrofaagantigenen zoals CD 68 of ED 1 en CD 1 72 A of OX 41. Deze cellen bezitten functionele eigenschappen van macrofagen, zoals actieve fagocytose van FITC-gelabelde microbeads.

In deze video hebben we een eenvoudige en efficiënte methode gepresenteerd om macrofagen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van rode levercellen van volwassen dieren. Onze procedure vereist geen complexe apparatuur of vaardigheden, maar levert voldoende aantallen pure macrofagen op die herhaaldelijk kunnen worden geoogst uit dezelfde cultuur van brass. Deze methode kan worden toegepast op andere zoogdiersoorten.

Bedankt voor het bekijken van de video en veel succes met uw toekomstige experimenten. Groetjes.