Het kwantificeren van de Frequentie van Tumor voortplantende cellen met behulp van beperkte verdunning Cell Transplantation in syngene zebravis

De limiterende verdunningsceltransplantatie-assay is de gouden standaard voor het beoordelen van het zelfvernieuwingsvermogen in experimentele diermodellen. In deze demonstratie worden syngene zebrafish-embryoen in het een-celstadium geïnjecteerd met rag two MIC en RAG two GFP om transgene zebrafish te creëren die fluorescent gelabelde T-cel acute lymfoblastische leukemie zullen ontwikkelen. Tegen de 60e levensdag worden de primaire leukemiecellen uit de zebrafish geïsoleerd en vervolgens gezuiverd middels fluorescence-activated cell sorting.

Vervolgens worden de cellen bij een limiterende verdunning getransplanteerd in de peritoneale holte van volwassen zebravisjes, waarna de vissen tot 90 dagen worden gemonitord op tumorgroei. Ten slotte wordt het statistische softwareprogramma voor extreme limiterende verdunningsanalyse gebruikt om de frequentie van leukemie-propagerende cellen binnen de oorspronkelijke tumor te kwantificeren. Analyse van celtransplantatie bij limiterende verdunning stelt onderzoekers in staat om nauwkeurig het aantal zelfvernieuwende cellen in de bulk van de tumormassa vast te stellen.

Het zijn deze zelfvernieuwende cellen die de vorming van kanker aansturen en uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor het recidief. Het belangrijkste voordeel van het uitvoeren van limiterende verdunnings-transplantatieassays in het zebravismodel is dat er voor elk experiment veel vissen kunnen worden getransplanteerd, wat resulteert in een betere precisie bij het bepalen van de frequentie van zelfvernieuwende tumorpropagerende cellen. Deze methode biedt inzicht in tumorpropagerende cellen bij T-cel acute lymfoblastische leukemie.

Het kan ook worden toegepast om andere zebraviskankermodellen te begrijpen. Jessica Blackburn, een fellow in het lab, en Sally Liu, een getalenteerde technicus, zullen vandaag de procedure voor u demonstreren. Om de Rag2-CM- en RAG2-GFP-DNA-constructen te lineariseren, worden 10 µg van elk plasmide gedigesteerd met het restrictie-enzym NotI bij 37 °C gedurende de nacht. Na fenol-chloroformeextractie en ethanolprecipitatie suspenderen we elk plasmide in 20 µL water.

Bepaal de DNA-concentraties op een 1% agro-gel door een verdunning van één-op-één, één-op-vijf en één-op-tien van elk gedigesteerd plasmide uit te voeren, samen met 20 µL, 10 µL en 5 µL van een high range DNA-ladder. Verdun het DNA vervolgens tot een uiteindelijke concentratie van 60 ng/µL voor injectie in de CG one strain syngen. Injecteer in zebrafish-embryo's 250 nL van 30 ng/µL rag two CM en 30 ng/µL.

Inject twee GFP-constructen via Rag in zebravisembryo's in het eencellige stadium, waarbij het DNA zorgvuldig direct in de cel en niet in de dooier wordt geplaatst. Bewaar de geïnjecteerde embryo's bij 28.5 °C en verwijder de dode embryo's na 24 uur. Wanneer de dieren vijf dagen oud zijn, worden ze ongeveer 28 dagen na injectie overgebracht naar grote tanks. Anestheseer de larvale zebravisjes door 200 µL van 4 ng/mL trica S toe te voegen aan 25 mL vis-systeemwater in een Petrischaal.

Onderzoek de larven op de ontwikkeling van fluorescentie-gelabelde TALL met behulp van een epifluorescentiemicroscoop om GFP-fluorescentie te detecteren. Scheid tumorpositieve larven van de negatieve larven om te voorkomen dat leukemische vissen in de analyse worden gemist. Negatieve larven kunnen op een later tijdstip worden onderzocht, zodra de tumoren mogelijk groter zijn gegroeid. Monitor fluorescentie-gelabelde leukemische vissen ten minste één keer per week met de epifluorescentiemicroscoop om de tumorgroei te volgen.

Wanneer GFP-positieve leukemiecellen meer dan 50% van het dier hebben ingenomen, voeg dan één milliliter van vier nanogram per milliliter Tricaine S toe aan een Petrischaal met negen milliliter vissen-systeemwater om de vis te offeren. Plaats de vis in een nieuwe Petrischaal met één milliliter 5% foetaal runderserum in 0,9 X PBS en macereer de vis met een scheermesje; pipetteer het mengsel om grote celklonters te dissociëren. Breng de cellen vervolgens door een 40 micrometer mesh-zeef in een 50 milliliter buis.

Pipetteer 500 µL van de cellen in een polystyreenbuis van 4 mL. Voeg 1 µL propidiumjodide (1 mg/mL) toe om dode cellen te labelen, vortex en bewaar de cellen vervolgens op ijs. Bereid daarnaast een wildtype CG1-vis voor om normale bloedcellen te verzamelen, die dienen als drager voor de tumorcellen tijdens transplantatie, door 4 mL 5% FBS in 0,9 × PBS toe te voegen aan de 50 µL buis voor een totaalvolume van 5 mL.

Tel de normale bloedcellen en verdun deze tot 3 × 10⁵ cellen per milliliter in 5% FBS in 0,9 x PBS; pipetteer vervolgens 100 µL per putje van een 96-wells plaat. Gebruik een fluorescence activated cell sorter om GFP-positieve PI-negatieve tumorcellen in de 96-wells plaat met bloedcellen te sorteren tegen de aangegeven doses. Sorteer daarnaast 10.000 cellen in een putje zonder normale bloedcellen en analyseer deze opnieuw met FACS om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen te beoordelen. Centrifugeer de 96-wells plaat bij 2000 ×g gedurende 10 minuten om de cellen te pelletteren.

Verwijder 95 µL van het supernatant en resuspendeer de cellen in de resterende vijf µL. Injecteer de celsuspensie in de peritoneale holte van syngene zebravisjes van meer dan 60 dagen oud met behulp van een microspuit met een gauge van 26,5. De zebravisjes hoeven voor de transplantatie niet te worden geanestheseerd.

Transplanteer 45 vissen met 10 leukemiecellen, 20 vissen met 100 cellen, zeven vissen met 1000 cellen en vijf vissen met 10 000 TALL-cellen ongeveer 28 dagen na transplantatie. Onderzoek de ontvangende zebravissen met een epifluorescentiemicroscoop met een excitatiegolflengte van 485 20 en een emissiefilter van 530 25 om GFP-fluorescentie te detecteren.

Noteer het aantal positieve vissen ten opzichte van het totale aantal geïnjecteerde vissen. Controleer de vissen elke 14 dagen opnieuw tot maximaal 90 dagen en noteer het aantal positieve vissen. Wanneer het aantal tumorpositieve vissen toeneemt.

Offer het dier door een overdosis trica US, voer de resultaten in een tabel in en upload de gegevens naar de webgebaseerde software voor extreme limiting dilution-analyse om de frequentie van zelfvernieuwende leukemiecellen binnen de primaire TALL CG one-stam te bepalen; embryo's werden geïnjecteerd met RAG twee cmic en RAG twee GFP-larven werden gescreend op primaire TALL. Na 28 dagen, in overeenstemming met eerder werk, hebben ongeveer 5% van de geïnjecteerde vissen GFP-positieve T-cellen in hun thymus, en 100% van deze vissen zal leukemie ontwikkelen. Hier werden fluorescentielabelled TALL-cellen gesorteerd uit zieke dieren van 65 dagen oud en gebruikt in de limiting dilution-celtransplantatie-assay. Ten eerste werd een gate getrokken om enkelvoudige cellen te selecteren.

Vervolgens werden de propidiumjodide-negatieve cellen geselecteerd. Ten slotte werd een gate getrokken om alleen de GFP-positieve leukemiecellen te selecteren voor sortering. In dit voorbeeld van vissen waarin TALL was getransplanteerd, waren op dag 28 tumoren in een vroeg stadium zichtbaar als een gebied met GFP-positieve cellen nabij de injectieplaats.

Hoewel sommige TLS verder gevorderd waren en voor deze experimenten waren uitgebreid om de peritoneale holte te vullen, werden er meer dan 220 dieren getransplanteerd, wat door één persoon binnen enkele uren eenvoudig kan worden uitgevoerd. Data-analyse met elda-software toonde aan dat gemiddeld één op de 135 T-al-cellen zelfvernieuwende leukemie-propagerende cellen waren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe tumorcellen bij een limiterende verdunning in de peritoneale holte van syngenetische zebravissen kunnen worden getransplanteerd, en hoe de resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de frequentie van tumorpropagerende cellen binnen een bepaalde tumor te bepalen.

Verdere studies met gebruik van genetisch gemodificeerde dieren kunnen helpen bij het identificeren van de mechanismen die de zelfvernieuwing van deze tumorpropagerende cellen reguleren.