Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie
1 augustus 2011
Een In vivo Methode om gen-functie te testen in postnatale hersenen wordt beschreven. Recombinant AAVs uiten Cre-en / of een fluorescerend eiwit wordt geïnjecteerd in neonatale hersenen van muizen. Mozaïek gen inactivatie en schaars neuronale etikettering worden bereikt, waardoor een snelle analyse van de genfunctie in processen van cruciaal belang voor neurale circuit ontwikkeling.
Het algemene doel van deze procedure is om de genfunctie te manipuleren tijdens de postnatale periode van de hersenontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst de juiste virussen te selecteren en voor te bereiden, deze in de spuit te laden en de injectieapparatuur klaar te maken. Vervolgens wordt het virus in de hersenen van pasgeboren muizenpups geïnjecteerd, en de laatste stap is het opofferen van de dieren en het in beeld brengen van de geïnjecteerde regio's.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een differentiële labeling van controle- en knockout-cellen aantonen via immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de vraag hoe de periode van postnatale ontwikkeling genetisch wordt gereguleerd. Voor injectie kan een commercieel verkrijgbare adeno-geassocieerd virusoplossing bij volledige titer worden gebruikt, doorgaans 10¹² genoomkopieën per milliliter, om een groot aantal cellen te manipuleren.
Als een lage dichtheid of labeling gewenst is, begin dan met een verdunning van 1:10. Draai het virus ontdooiend op ijs en breng het volume voor de voorverdunning onmiddellijk over in een steriele PCR-buis van 250 microliter. Bewaar de verdunning op ijs.
Bereid de injectiepomp voor door een geschikte spuit te selecteren en deze aan een laadnaald te verbinden. Trek vervolgens voorzichtig de virusoplossing op totdat er een zeer kleine luchtbel in de spuit zichtbaar is; een inerte laadkleurstof kan worden gebruikt om deze stap te vergemakkelijken. Bevestig de spuit nu met een houder aan de pomp.
Bevestig vervolgens voorzichtig de verbindingsslang tussen de spuit en de naaldhouder. Zorg ervoor dat de injectienaald in direct contact staat met de verbindingsslang binnenin de naaldhouder. Beweeg de oplossing nu langzaam door de verbindingsslang totdat er een klein druppeltje oplossing zichtbaar is bij de naaldpunt.
Bevestig de zuiger zorgvuldig naast het duwblok met een beugel op de pomp. Stel de injectiesnelheid in op 8 µL per minuut en het injectievolume op tussen 1 en 2 µL. Pas vervolgens de instelling voor de spuitdiameter van de pompen aan zodat deze overeenkomt met de diameter van de gebruikte spuit.
Ten slotte, om de pups tijdens de herstelfase te beschermen, stelt u de warmteplaat in op 38 °C en bedekt u deze met een papieren handdoek. Bereid P0- of P1-muispups voor op injectie door middel van koude anesthesie volgens een door de IACUC goedgekeurd protocol. Maak enkele papieren handdoeken vochtig met water en plaats deze op ijs.
Plaats vervolgens vier of vijf pups goed gescheiden van elkaar op het keukenpapier. Vouw het keukenpapier voorzichtig over de pups heen, plaats een kleine hoeveelheid gecrusht ijs bovenop het keukenpapier en laat de pups ongeveer vijf minuten incuberen. De pups kunnen veilig tot 15 minuten op ijs worden bewaard en zullen nog steeds een goed herstel vertonen.
Plaats nu een geanestheseerde pup op een montageblok voor een optimale toegang tot de injectieplaats. De cortex is bijvoorbeeld het gemakkelijkst toegankelijk door het dier plat op de buik te leggen. De pup kan met een pleister worden vastgezet; stabiliseer de kop van de pup handmatig en trek de huid strak om te voorkomen dat deze beweegt.
Navigeer vervolgens naar anatomische herkenningspunten van de schedel, zoals de lambdasuutuur, en selecteer met de andere hand een reproduceerbaar injectiepunt; voer de naald vervolgens voorzichtig door de schedel in. Duw niet hard als de naald de schedel niet gemakkelijk penetreert. Positioneer de naald in dat geval opnieuw en probeer het voorzichtig opnieuw.
De injectiediepte voor de cortex varieert enigszins tussen individuele dieren en stammen; een diepte van een halve tot één millimeter is gewoonlijk effectief. Injecteer nu de virusoplossing terwijl een collega de pomp activeert om handbewegingen te minimaliseren. Idealiter kan een voetpedaal worden gebruikt om de pomp na de injectie te starten.
Houd de naald enkele seconden op zijn plaats en houd vervolgens de kop van de pup rustig vast. Schuif de naal voorzichtig naar buiten. Laat de pup nu vijf tot 10 minuten herstellen op de afgedekte warmteplaat.
Ga gedurende deze tijd door met het injecteren van de andere pups. Wanneer alle pups hun roze kleur hebben teruggekregen en allemaal bewegen, wrijf ze dan voorzichtig in met een deel van hun eigen nestmateriaal. Pas daarna kunnen ze bij hun moeder worden teruggeplaatst.
Anders zouden ze als onbekende jongen kunnen worden behandeld, die de moeder waarschijnlijk zal doden nadat de jongen bij haar zijn teruggeplaatst. Reinig de injectie-opstelling door de spuit volledig te vullen met aceton of 70% ethanol. Indien er acetongevoelige componenten zoals sano, acurate of adhesieven worden gebruikt, spoel de oplossing dan meerdere keren door de injectie-opstelling, waarbij telkens een nieuwe oplossing wordt gebruikt.
Dit verwijdert alle resterende virusoplossing en neerslag, waarna de oplosmiddelen zullen verdampen. Ontinfect na het doorspoelen van de opstelling het werkgebied met bleekmiddel, zodat het klaar is voor de volgende experimentator. Een succesvolle techniek resulteert in een robuuste neuronale infectie op de injectieplaats.
Injecties in specifieke regio's, zoals de cortex en de colliculus superior, veroorzaken doorgaans lokale infecties met minimale verspreiding naar aangrenzende regio's. Het gebruik van een virusoplossing met een hoge titer maakt infectie van aangrenzende gebieden, zoals de hippocampus, waarschijnlijker, terwijl injectie met een virusoplossing met een lage titer resulteert in een spaarzame infectie, doorgaans nabij de injectieplaats, zoals bij een cerebellaire injectie op de middenlijn; het aantal geïnfecteerde cellen dient te correleren met de titer van de geïnjecteerde virusoplossing.
Wanneer bijvoorbeeld een mengsel van hoog-titer oplossingen van twee rAAV8-virussen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in het cerebellum wordt geïnjecteerd, worden veel kinji-cellen geïnfecteerd die differentieel gelabeld zijn. Omgekeerd kan het injecteren van een virusoplossing met een laag titer leiden tot een verspreide infectie om de visualisatie van individuele cellen te vergemakkelijken. Fluorescerend gelabelde neuronen kunnen direct worden geobserveerd in vers gesneden levend weefsel, of ze kunnen worden onderworpen aan immunokleuring.
Dit versterkt de endogene fluorescentiesignalen voor latere beeldacquisitie via widefield- of confocale fluorescentiemicroscopie. Ten slotte is RAAV eight in staat om diverse neurontypen in de cortex te infecteren, met een sterke labeling van fijne uitlopers. Zodra de methode onder de knie is, kan deze techniek in ongeveer 30 minuten worden uitgevoerd indien dit correct gebeurt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in vivo methode voor het testen van genfuncties tijdens de postnatale hersenontwikkeling met behulp van recombinante AAV's. Door deze virussen in de hersenen van pasgeboren muizen te injecteren, kunnen onderzoekers mozaïekachtige geninactivatie en schaarse neuronale labeling bereiken, wat de analyse van genfuncties in de ontwikkeling van neurale circuits vergemakkelijkt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genfunctie
- Ontwikkeling van Neurale Circuits
Achtergrond
- Het begrijpen van genfuncties tijdens de postnatale hersenontwikkeling is cruciaal.
- Recombinante AAV's kunnen worden gebruikt om genexpressie te manipuleren.
- Deze methode maakt het mogelijk om genetische regulatie tijdens kritieke ontwikkelingsperioden te bestuderen.
- Immunofluorescentiemicroscopie kan onderscheid maken tussen controlecellen en knockoutcellen.
Doel van de studie
- Om genfuncties te manipuleren tijdens de postnatale periode van de hersenontwikkeling.
- Om te onderzoeken hoe genetische factoren de postnatale neurale ontwikkeling reguleren.
- Om inzicht te verschaffen in de mechanismen die ten grond liggen aan de vorming van neurale circuits.
Gebruikte methoden
- Selectie en preparatie van geschikte recombinante AAV's.
- Injectie van virussen in de hersenen van pasgeboren muizenpups.
- Immunofluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van de geïnjecteerde regio's.
- Analyse van differentiële labeling van controle- en knockoutcellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle geninactivering en neurale labeling zijn bereikt.
- De resultaten demonstreerden de genetische regulatie van de postnatale ontwikkeling.
- De methode biedt een kader voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan het begrip van de dynamiek van neurale circuits.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van genfuncties in de ontwikkelende hersenen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de ontwikkeling van neurale circuits.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze benadering om genetische invloeden op gedrag te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt een snelle, schaalbare analyse van genfuncties tijdens de postnatale hersenontwikkeling mogelijk, waarmee een kritisch gat in de validatie van targets voor neuro-ontwikkelingsstoornissen wordt gedicht. Door de beperkingen van embryonale letaliteit te omzeilen, ondersteunt het de mechanistische risicoreductie van therapeutische targets in pathways die relevant zijn voor autisme en schizofrenie. De benadering biedt voorspellende zekerheid bij de selectie van targets door genetische perturbatie te koppelen aan fenotypes op circuitniveau in een fysiologisch relevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genfunctie in postnatale neurale circuits mogelijk, waar veel genen die betrokken zijn bij neuroontwikkelingsstoornissen hun effecten uitoefenen.
- Operationele waarde: Behaalt mozaïekachtige geninactivering en schaarse labeling binnen enkele dagen, waardoor het maandenlang genereren van conditionele muismodellen wordt vermeden.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt celautonome functionele analyse van genen die betrokken zijn bij axonale groei, dendritische tiling en synaptische verfijning.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief vergelijkbare controle- en knockout-celpopulaties via differentiële fluorescente labeling voor een zij-aan-zij fenotypische beoordeling.
- Operationele waarde: Maakt titratie van de virale titer mogelijk om de infectiedichtheid te moduleren, waardoor schaalbare ijle of dichte labeling mogelijk is, afhankelijk van de behoeften voor downstream-assays.
- Wetenschappelijke waarde: Compatibel met immunofluorescentie en elektrofysiologische read-outs, wat multimodale validatie van target-engagement en circuit-impact faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert postnatale genetische perturbatie bij muizen en ratten, wat overeenkomt met de timing van de ontwikkeling van neuropsychiatrische stoornissen bij mensen.
- Operationele waarde: Kan worden uitgebreid naar lentivirale levering en shRNA/dominant-negatieve constructen, waardoor de toolkit voor targetmodulatie voor preklinische validatie wordt verbreed.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om genfuncties te bestuderen in kritieke processen zoals synaptogenese, wat direct relevant is voor pathofysiologische mechanismen bij psychiatrische stoornissen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking en ondersteunt targetvalidatie en leadidentificatie door causaal genetisch bewijs te leveren in postnatale neurale circuits voorafgaand aan compound-screening.
- Discovery Biology: Test therapeutische hypothesen door kandidaatgenen in gedefinieerde hersengebieden te deleten om de fenotypische gevolgen voor de rijping van neurale circuits te beoordelen.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde, reproduceerbare neuronale preparaten met interne controles (gelabelde versus ongelabelde cellen) voor een betrouwbare meting van het effect van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve imaging- en elektrofysiologische read-outs die statistische vergelijking van genotypen en behandelcondities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt genetische manipulatie met uitkomsten op circuitniveau, wat bijdraagt aan de preklinische validatie van targetmodulatie die is afgestemd op biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar viraal afleverplatform dat toepasbaar is op meerdere genetische targets en hersengebieden, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie door postnatale genverlies te koppelen aan specifieke circuitfenotypes.
- Operationele waarde: Standardiseert genperturbatie via virale aflevering, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en studies wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen door snel genetische causaliteit vast te stellen in ziekterelevante postnatale vensters.
- Impact op portfolio: Vermindert het risico bij de verdere ontwikkeling van targets door functioneel bewijs te leveren in systemen die de timing van de menselijke neuro-ontwikkeling modelleren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van neonatale muizen, stereotaxische injectie en protocollen voor virale biosafety.
- Afhankelijk van toegang tot gezuiverde recombinante AAV- of lentivirale vectoren en infrastructuur voor fluorescentiemicroscopie.
- Vereist standaardisatie van de virale titer, het injectievolume en de anesthesieprocedures voor consistentie tussen studies.
- Aanpassing aan verschillende hersenregio's of soorten kan optimalisatie van de injectiecoördinaten en het tropisme van het virale serotype vereisen.
- Praktische beperking: de effectiviteit is afhankelijk van de efficiëntie van Cre-recombinase en de beschikbaarheid van gefloxeerde allelen, wat per target kan variëren.
