Shape Memory Polymeren voor actieve cel Cultuur

Het algemene doel van deze procedure is om cellen te kweken op een substraat met een topografie die in de loop van de tijd verandert. Dit wordt bereikt door een vormgeheugenpolymeer eerst te programmeren in een permanente vorm die kan worden onthouden. Vervolgens wordt het vormgeheugenpolymeer geprogrammeerd in een tijdelijke vorm waarop de cellen later worden gezaaid.

De laatste stap van de procedure is het triggeren van het vormgeheugenpolymeer om terug te keren naar zijn permanente vorm door de temperatuur te verhogen, waarna uiteindelijk resultaten kunnen worden verkregen die een verandering in het celgedrag aantonen via fluorescentiemicroscopie. Hallo, mijn naam is Pat Mather. Ik ben professor biomedische en chemische technologie en directeur van het Syracuse Biomaterials Institute hier aan de Syracuse University.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van commerciële of op maat gemaakte apparatuur voor het rekken van cellen is dat we binnen een enkel polymeersysteem in staat zijn om een breed scala aan complexe rekspanningen op cellen toe te passen. Mijn naam is Jay Henderson. Ik ben assistent-professor Biomedische en Chemische Techniek en lid van het Syracuse Biomaterials Institute.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de mechanobiologie, zoals de vraag hoe cellen reageren op dynamische veranderingen in hun fysieke omgeving. Mijn naam is Kevin Davis en ik ben een PhD-student aan de Syracuse University in het Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in 2D mechanische biologie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals 3D vormveranderende scaffolds voor tissue engineering.

Bereid vóór aanvang van deze procedure een op maat gemaakte uithardingskamer voor met een glazen objectglas, een Teflon-afstandsstuk van één millimeter dik en een aluminiumplaat. Bevestig de kamer met kleine klemmetjes, injecteer vervolgens NOA 63 in de kamer via een gat in het Teflon-afstandsstuk met een naald van 18 gauge. Plaats de kamer daarna op een warmteplaat die is ingesteld op 125 °C.

Laat de kamer na het opwarmen vijf minuten lang op een uniforme temperatuur komen. Laat de NOA 63 gedurende 20 minuten uitharden door een UV-lamp op 6,5 centimeter van het glasoppervlak te plaatsen. Verwijder de NOA 63 met een scheermesje uit de kamer terwijl deze nog warm is.

Nacureer vervolgens het vormgeheugenpolymeer gedurende drie uur en 40 minuten onder UV-licht, direct op de warmteplaat bij 125 °C. Om het vormgeheugen van de NOA 63 te karakteriseren, wordt een haltervormig monster geprepareerd door de gecureerde film warm te persen met een aangepaste pons. Plaats tot slot het monster in een dynamische mechanische analyse-apparaat met een trekbevestiging.

Stel het instrument in op de krachtgestuurde modus en programmeer de testprocedure zoals beschreven in het schriftelijke protocol dat bij deze video is gevoegd. Het resultaat van de procedure is een isotheremisch uitgehard vormgeheugenpolymeer of SMP-film. Plaats de CSMP op een warmteplaat en stel de temperatuur hoger in dan de glastransitietemperatuur om de modulus te verlagen en het snijden te vergemakkelijken. Bereid individuele monsters voor vanuit de isotheremisch uitgeharde SMP-film.

Snijd de s- en p-film met een scheermes op de gewenste monstergrootte. De tijdelijke vorm kan op verschillende manieren worden gefixeerd. Hier wordt een hydraulische tafelpers met platen die verwarmd en gekoeld kunnen worden gebruikt om een tijdelijke topografie te embosseren.

Stel eerst de temperatuur van de PLA's in op een temperatuur boven de tg. Voor deze demonstratie werd een embosser gemaakt door epoxy te uitharden op een vinylplaat om een tijdelijke vorm van parallelle groeven te creëren. De embosser kan van andere materialen en met verschillende topografieën worden gemaakt, maar moet stijver zijn dan de NOA 63.

Plaats bij de embossing-temperatuur de s- en p-monsters met de voorkant naar beneden op de embosser. Plaats vervolgens de monsters en de embosser in de pers. Breng een voorlast van ongeveer 100 kilo pascals aan om contact te maken tussen de verwarmde PLA's en de monsters; houd dit ongeveer vijf minuten vol om de monsters een uniforme temperatuur te laten bereiken.

Zodra een uniforme temperatuur is bereikt, wordt er een druk van één tot zes megapascal op de monsters uitgeoefend gedurende één minuut. Het SMP zal fractureren. Indien er een grotere spanning wordt toegepast.

Pas kleinere spanningen toe om topografieën met kleinere amplitudes te introduceren. Nadat de druk is aangebracht, wordt de temperatuur verlaagd tot onder de TG door gebruik te maken van de waterkoelingsfunctie van de persplaten. Wanneer de temperatuur onder de tg ligt, wordt de uitgeoefende kracht verwijderd voordat het actieve celkulturexperiment wordt gestart.

Het UV-licht van de biologische veiligheidskast wordt gebruikt om de monsters te steriliseren. Plaats de monsters met de voorkant naar beneden in steriele schaaltjes zonder deksels en schakel het UV-licht zes uur lang in. Draai de monsters vervolgens om naar nieuwe steriele schaaltjes in de positie met de voorkant naar boven.

Schakel het UV-licht voor nog eens zes uur in. De monsters moeten worden geëquilibreerd naar een relatief stabiele toestand voordat ze met cellen worden geplaat. Plaats de monsters in een 96-wellplaat en voeg 150 µL compleet groeimedium toe.

Medium per putje. Plaats de plaat in een incubator van 30 °C met 5% CO2 totdat het gewenste gedeeltelijke herstel is bereikt. Voor deze demonstratie worden de monsters 30 uur geïncubeerd om een voldoende grote amplitude te genereren om de cellen uit te lijnen.

Zodra gedeeltelijk herstel is bereikt, kunnen de monsters met cellen worden geplaatst. Plaats de monsters in een nieuwe 96-wells plaat. Voeg vervolgens 150 microliters celoplossing toe aan elk van de monsters hier, C3 H 10 t en een half.

De meeste embryonale fibroblasten worden gebruikt in een concentratie van 20.000 cellen per milliliter. Om geïsoleerde cellen te verkrijgen, laat men de cellen hechten en uitspreiden op de tijdelijke topografie door deze 9,5 uur te incuberen bij 30 °C. Analyseer vervolgens de celmorfologie vóór de transitie door monsters te nemen en deze te kleuren en te visualiseren met fluorescentie-imaging.

Dit materiaal vertoont autofluorescentie over het grootste deel van het UV- en zichtbare spectrum; fluoroforen in het verrode uiteinde van het spectrum, zoals Alexa Fluor 647, worden aanbevolen om de achtergrond te verminderen. Om de monsters te laten herstellen, wordt de plaat verplaatst naar een incubator van 37 °C en wordt de kweek gedurende 19 uur voortgezet. Dit stelt het materiaal in staat om te herstellen en de cellen om hun morfologie aan te passen aan de nieuwe topografie. Na incubatie worden de juiste kleurstoffen aangebracht, zoals phalloidine voor beeldvorming van filamenteus actine.

Als laatste stap kunnen de cellen worden afgebeeld op de nieuwe topografie; hier wordt de bulk one-way shape memory van een enkele NOA 63-uitharding getoond. Dit is drie keer herhaald, waarbij het sterretje de experimentele start van de uitharding aangeeft. NOA 63 is een transparante, glasachtige vaste stof met uitstekende vormgeheugeneigenschappen.

In dit geval was het materiaal uitgehard en vertoont het een uniforme TG van 51.1 °C, bepaald op basis van het begin van de daling van de opslagmodulus. De hier waargenomen daling in rek vindt plaats bij de gemeten tg. Een groot percentage van de aangebrachte rek van 4.7% bleef vaststaan na ontlasting bij 20 °C, wat overeenkomt met een fixatieverhouding van 89.3%. De vaste rek werd vervolgens hersteld met een verhouding van 84.4% binnen een relatief klein temperatuurbereik tijdens het verwarmen.

De vormgeheugenprestaties vertoonden geen verslechtering tot drie cycli, zoals blijkt uit het feit dat alle curven bijna exact hetzelfde pad volgen. De amplitude van de tijdelijke topografie neemt in de loop van 30 uur bij 30 °C af. Bij 30 °C.

De amplitude is met ongeveer 50% verminderd, zoals hier wordt aangegeven op tijdstip nul. Deze neemt over de volgende 9,5 uur met nog eens 10% af. Wanneer herstel wordt geïnduceerd door de temperatuur te verhogen naar 37 °C, daalt de amplitude binnen 9,5 uur tot 0,5% van de initiële amplitude voor de gebruikte embosser en een embossing-spanning van 4,9 MPa.

Dit komt overeen met een functionele verandering van groeven van 13 micrometer naar een nagenoeg vlak oppervlak. Dit polymeer herstelt zich in het temperatuurbereik van 30 tot 37 graden onder celkweekcondities. Dit is te danken aan wateropname uit het kweekmedium; het water plastificeert het polymeer, waardoor de tg verlaagt, wat herstel mogelijk maakt bij temperaturen onder de droge TG van 51 graden.

Een voorbeeld van een celgedrag dat wordt gestuurd via het gebruik van actieve celkweeksubstraten is een verandering in de organisatie van het cytoskelet op tijdelijke gegroefde substraten. Voordat het herstel wordt geactiveerd, richten de actinemicrofilamenten zich uit in de richting van de groeven. Na herstel door een temperatuurstijging zijn de microfilamenten gereorganiseerd en willekeurig georiënteerd.

Omgekeerd reorganiseren controlemonsters met statische, vlakke oppervlakken of statische groeven niet na een temperatuurstijging. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de geometrie van de uithardingskamer, de overgangstemperatuur van het polymeer, de methode van rekfixatie en de samenstelling van het polymeer zelf kunnen worden aangepast om de gewenste overgang in uw eigen experiment te bereiken na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de genexpressie verandert als reactie op de mechanische stimulatie vanuit het substraat na de ontwikkeling ervan.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de celmechanobiologie om het celcytoskelet, reorganisatie en zachte materiefysica in twee dimensies te onderzoeken. Bedankt voor uw interesse in ons werk en bedankt voor het kijken.