Multi-electrode array Opnamen van neuronale Lawines in organotypische culturen

Het doel van dit experiment is om de zelforganisatie van gezonde hersenactiviteit in neuronale avalanches te bestuderen, het kenmerk van kritische toestandsdynamiek in de cortex. Dit wordt bereikt door een coronale gelaagde cortexsnede te combineren met een midbrainsnede, die ontwikkelingsbiologisch belangrijke dopaminerge input naar de cortex levert. In een tweede stap wordt de cortex-midbrain co-cultuur gekweekt op een multi-electrode array, wat stimulatie en registratie van neuronale activiteiten op meerdere locaties in de cultuur mogelijk maakt.

Vervolgens laten we de co-cultuur platdrukken, uitbreiden en hechten aan het MEA-oppervlak gedurende de eerste één tot twee weken in een speciaal ontworpen incubator, die de cultuur cyclisch blootstelt aan normale lucht en medium. De verkregen vloeistofresultaten tonen de spontane zelforganisatie van spatiotemporele lokale veldpontentiaalbursts in neuronale avalanches. Dit is gebaseerd op MEA-opnamen en offline avalanche-analyse waarmee de machtswet in de grootte van de avalanches wordt geïdentificeerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gedissocieerde culturen, is het systeemneurowetenschappelijke aspect. We kunnen vele hersengebieden samen co-cultureren, en deze multi-regio culturen vestigen een hersenorganisatie die op grote schaal correct is, zoals bij corticale lagen en projectiesystemen. Toepassingen van deze techniek strekken zich verder uit dan alleen de studie van neuronale lawines.

We kunnen bijvoorbeeld de stimulusrespons op netwerkniveau bestuderen onder nauwgezet gecontroleerde in vitro-condities. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de juiste toepassing van het plasmathrombinemengsel en het positioneren van het weefsel op de MEA moeilijk aan te leren zijn. Deze stappen vereisen een nauwkeurige timing, de juiste temperatuurgradiënt en dat het delicate MEA-oppervlak niet direct wordt aangeraakt.

Om een steriele, afsluitbare glazen kamer voor opnames voor te bereiden, snijdt u eerst geschroefde glazen cilinders met een Teflon plastic dop af, ongeveer twee millimeter vanaf de onderkant van de schroefdraad. Deze zijn nodig voor een veilige en luchtdichte afsluiting van de kweekkamer. Reinig vervolgens de glazen ringen door ze drie keer met water te spoelen en daarna vijf minuten te koken in 200 proof ethylalcohol.

Leg deze opzij om te drogen. Er is een siliconenoplossing nodig om de glazen ringen aan het MEA-oppervlak te bevestigen. Gebruik een Cell Guard 180 4 siliconen elastomer kit en meng 15 milliliter van deel A en B grondig. Laat dit vervolgens 15 minuten rusten om luchtbellen te verwijderen.

Verdeel de oplossing in aliquots van 1 mL en bewaar deze bij -20 °C voor toekomstig gebruik. Lijm nu een glazen ring aan de MEA door 1 mL siliconen bij 23 °C op te zuigen in een spuit met een naald van een klein kaliber en dit aan te brengen op het ongepolijste snijvlak van de glazen ring. Centreer vervolgens de glazen ring op de MEA en breng een extra laag siliconen aan rond de buitenkant van de ring voor een sterkere afdichting.

Laat dit één tot twee uur uitharden bij ongeveer 60 °C op een warmteplaat. Steriliseer vervolgens de MEA-kamer en de dopjes van de kamer onder een laminaire flowkap door deze drie keer te spoelen met gedeïoniseerd water en daarna drie keer met 70% alcohol voor de laatste spoelbeurt. Laat de kamer 10 minuten in de alcohol staan.

Stel vervolgens het interieur van de kamer en de dop 10 minuten lang bloot aan UV-licht. Autoclaveer gedurende 45 minuten bij 120 °C. Laat deze na sterilisatie drogen.

Coat nu het MEA-oppervlak in de kweekkamer met poly-D-lysine. Nieuwe MEA's zoals gebruikt in dit experiment zijn vrij lipofiel, daarom moet er worden gecoat door herhaalde druppeltoevoeging. Aspireer de oplossing van het elektrodenrooster.

Plaats de dop om de MEA-kamer af te sluiten voor opslag en toekomstig gebruik. Deze procedure levert cortex- en VTA-secties op voor ongeveer 12 co-culturen en moet worden uitgevoerd in een laminaire flowkast onder steriele omstandigheden met gezonde dieren van één tot twee dagen postnataal; de totale tijd voor de weefselcollectie moet minder dan één uur bedragen. Begin na de decapitatie met het verwijderen van de hersenen door eerst twee laterale scharenknipsen te maken om de huid van de hoofdhuid te verwijderen.

Verwijder de schedel en knip deze vervolgens open met een fijne oogschaar, waarbij één sagittale snede in de middenlijn en één coronale snede bij de overgang van de cortex naar het cerebellum worden gemaakt. Klap deze vier schedelflappen naar achteren om de hersenen bloot te leggen. Snijd vervolgens met een aangescherpte spatel frontaal door de bulbus olfactorius.

Beweeg de spatel vervolgens in kwartslagbewegingen onder de hersenen. Til de hersenen voorzichtig uit de schedel en laat ze in een gekoelde gaze-oplossing glijden voor snelle koeling en tijdelijke bewaring.

Herhaal de bovenstaande procedure voor nog twee hersenen. Om VTA-weefsel te verkrijgen, worden de hersenen overgebracht naar een steriele, droge Petrischaal. Verwijder met een kleine spatel alle overtollige vloeistof door elk brein voorzichtig ongeveer één centimeter zijwaarts te verschuiven.

Gebruik vervolgens een scheermesje om de hersenstam te verwijderen door een verticale coronale snede te maken ter hoogte van het cerebellum. Plak nu een agarblokje op een montage schijf voor mechanische stabilisatie van de hersenen tijdens de snijprocedure. Breng vervolgens met een klein spateltje een dun lijntje secondelijm aan op de schijf, enkele millimeters vóór het agarblokje, maar voorkom dat de lijm het agar raakt.

Transfer elke hersenhemisfeer en monteer deze met de frontale pool naar beneden. Zorg ervoor dat de frontale polen aan de montage-schijf zijn gelijmd en dat de ventrale zijden de agar raken zonder lijmresten. Dit waarborgt een goede mechanische stabilisatie tijdens het snijden en een eenvoudige verwijdering van de gesneden coupes.

Dompel vervolgens de montage-schijf met de gemonteerde hersenen voorzichtig onder en zet deze vast in een vibram-tray gevuld met gekoelde gaze-oplossing. Snijd daarna met een zorgvuldig gereinigd scheermes coronaire secties van 400 micrometer dikte van de middenhersenen bij de hoogste vibratiefrequentie en een relatief lage voorwaartse snelheid. Gebruik een omgekeerde pasta-pipet met zuigknop om de coupes die de VTA bevatten te verzamelen en over te brengen naar Petri-schalen van 35 bij 10 millimeter, gevuld met steriele gekoelde gaze-oplossing voor corticale secties. Herhaal de voorgaande snijstappen, maar maak een verticale snede tussen de cortex en het cerebellum en monteer de vier hersenen met de frontale pool naar boven.

Neem ongeveer drie coronale coupes met een dikte van 350 micrometer, beginnend ter hoogte van het striatum. Dissekeer vervolgens, met behulp van een micro-mes gemaakt van gebroken scheermesjes, coronale secties van ongeveer twee millimeter breed van de frontale cortex en de middenhersengebieden die het VTA bevatten onder een stereomicroscoop. Verzamel de weefselsecties afzonderlijk in kleine schaaltjes gevuld met gekoelde gaze-oplossing.

Om te beginnen met het monteren van het weefsel in de eerste positie van de MEA-kamer, wordt de MEA bij kamertemperatuur onder een stereomicroscoop geplaatst met de elektrodematrix in focus. Centreer vervolgens een druppel plasma van 25 µL op de schone, stofvrije en steriele elektrodematrix. Schuif met een kleine spatel voorzichtig een sectie van de cortex en de VTA in de plasmadruppel.

Plaats de MEA nu op een koelplaat en stel het beeld opnieuw scherp. Laat dit ongeveer 15 seconden afkoelen voordat u 25 µL trombine aan de plasmadruppel toevoegt. Verspreid vervolgens het plasma-trombine mengsel voorzichtig over de MEA met kleine cirkelvormige bewegingen met de trombine-pipetpunt.

Zorg ervoor dat u de breekbare elektrode-array niet direct aanraakt. Plaats vervolgens de cortex voorzichtig op de array, waarbij de dorsale rand langs de tweede elektrode-rij van de array wordt gepositioneerd. Op deze manier zullen de ontwikkelende oppervlakkige lagen uiteindelijk de rest van de array bedekken.

Plaats vervolgens de VTA naast de ventrale rand van de cortexsectie. Sluit nu de MEA-kamer af met een dop en draai deze losjes aan om een hoge luchtvochtigheid te behouden. Laat de MEA-kweekopstelling ongeveer zes minuten in de zuurkast bij kamertemperatuur rusten om plasma-trombine, coagulatie en elutie mogelijk te maken.

Herhaal ondertussen de procedure om drie extra culturen voor te bereiden. Voeg vervolgens voorzichtig, in kleine druppels, 600 µL kweekmedium toe aan de kweekkamers met behulp van een spuit van 1 cc met een naald van 25 by five eighth gauge. Sluit daarna de MEA-kamer stevig af en plaats de MEA-kweekeenheid op de schommelende bewaarlade in de incubator.

Voeg na twee dagen in vitro 10 µL mitose-remmer toe. Vernieuw vervolgens het kweekmedium voor 60% na vier dagen in vitro en daarna elke vier dagen. Tijdens de normale groei zal de kweek aanzienlijk afplatten en dorsaal iets uitbreiden.

Vanwege de ontwikkeling van oppervlakkige corticale lagen wordt een gezonde cultuur in brightfield herkend aan het ondoorzichtige grijzige weefsel. Omgekeerd zijn heldere reflecterende blaasjes, een kenmerk van dode degeneratieve cellen ongeveer 10 tot 12 dagen na het aanmaken van de culturen, een teken dat ze klaar zijn voor registratie en stimulatie. Om een registratiesessie te starten, wordt de MEA van de bewaarschaal naar de registratiekop verplaatst.

Om het lokale veldpotentiaal of LFP te registreren, gebruikt u een banddoorlaatfilter van 1 tot 200 hertz. Multi-unit activiteit kan ook worden bestudeerd met een banddoorlaatfilter van 300 tot 3000 hertz. Gezonde spontane activiteit treedt doorgaans op in bursts van uiteenlopende grootte en duur.

Om de relatie tussen LFP en unit-activiteit te bestuderen, kunnen we spike-getriggerde gemiddelden van LFP berekenen. Voor deze cortexculturen correleren negatieve LFP-deflecties met neuronale spiking bij het registreren van stimulus-evokeerde activiteit. Eerst worden de temporele golfvorm en amplitude van de stimuli gespecificeerd met software die een stimulusgenerator aanstuurt.

Een nuttig stimulatieparadigma is de stroomgestuurde, ladingneutrale enkele schok met een bipolaire blokgolf. Vervolgens wordt een elektrode geselecteerd die gebruikt zal worden om de stimuli toe te dienen. Typische stimulus-evokeerde LFP-responsen lijken op spontane activiteitsbursts.

Blankerschakelingen ontkoppelen de versterkers tijdens de stimulatie om stimulusartefacten te verminderen en verzadiging van de versterker te voorkomen. De stimulatie-elektrode heeft enkele seconden nodig om te herstellen van de stimulatie en kan daarom niet worden gebruikt voor het registreren van responsactiviteit. Op de MEA neigt activiteit zich te manifesteren in spatiotemporele clusters, waarbij activiteit bij één elektrode vaak gepaard gaat met activiteit op andere locaties.

Tegelijkertijd worden hier typische golfvormen van de LFP tijdens dergelijke activiteitsperioden getoond door drie clusters die enkele seconden uit elkaar liggen voor elk cluster over elkaar heen te plotten. Negatieve LFP-deflecties zijn zichtbaar bij verschillende elektroden binnen een venster van één seconde; bij het extraheren van NLFP-pieken die een drempelwaarde van meerdere negatieve sd overschrijden, wordt de activiteit in de vorm van NLFP-piektijden handig gevisualiseerd in een Rasta, waarin kolommen met stippen nagenoeg gelijktijdige NPS bij diverse elektroden representeren. De spatiotemporele organisatie van deze activiteit is vrij complex.

Kolommen die bij een lage temporele resolutie min of meer homogeen lijken, zijn bij een hogere temporele resolutie samengesteld uit afzonderlijke clusters, enzovoort. Het ontstaan van ruimtelijke, GEOTEMPORALE en LFP-clusters is sterk georganiseerd in corticale netwerken. Meer specifiek is de organisatie schaalinvariant voor neuronale avalanches.

Dit wordt aangetoond door de waarschijnlijkheid van clustergroottes bij een gegeven temporele resolutie, Delta T, te berekenen. Hier bestaan clusters uit NL FPS die voorkomen in dezelfde of opeenvolgende tijdsintervallen; wanneer de grootte van een dergelijk cluster wordt uitgedrukt in het totaal aantal NFPS per cluster of geïntegreerde NLFP-amplitudes per cluster, vertonen de clustergrootteverdelingen een machtswet met een exponent dicht bij minus 1,5. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u hersenweefsel zorgvuldig kunt dissekeren en culturen kunt kweken op multi-elektrode-arrays om de zelforganisatie van neuronale activiteit te bestuderen.

Deze methoden zijn ook gebruikt om de relatie tussen spontane activiteit en stimulus-opgewekte activiteit in corticale netwerken te bestuderen.