Aseptische Laboratoriumtechniek: Plating Methoden

[Narrator] Dit protocol maakt gebruik van aseptische technieken bij uitplaatmethoden die worden gebruikt om micro-organismen zoals bacteriën en fagen te isoleren, te kweken of te tellen. De procedures omvatten uitstrijkplaten van bacteriële culturen om enkelvoudige kolonies te isoleren. Gietplaten om de concentratie van bacteriën te bepalen. En uitplaatmethoden (spread plating) om levensvatbare bacteriële kolonies te tellen. Soft agar overlays worden gebruikt om fagen te isoleren en plaques te tellen, terwijl replica-plating cellen van de ene plaat naar de andere overbrengt in een identiek ruimtelijk patroon. Uiteindelijk variëren de praktische toepassingen van deze technieken voor het kweken van micro-organismen van de identificatie van bacteriën in omgevingen tot technologische vooruitgang in de moleculaire genetica en high-throughput bioassays.

- Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze uitplaatmethoden problemen ervaren, omdat de handelingen zorgvuldige en gecoördineerde bewegingen vereisen om contact met niet-steriele oppervlakken te vermijden. Het aanleren van deze routineprocedures vereist training en oefening. De procedures zullen worden gedemonstreerd door mijn laboratoriumcoördinator, Dr. Kris Reddi.

- [Narrator] Begin het werk met micro-organismen door de laboratoriumregels en veiligheidsvoorschriften te kennen, inclusief biohazard-classificatie, decontemplatie van afval en verwijdering. Bevestig dat alle instrumenten, oplossingen en media voor uitstrijkprocedures steriel zijn. Creëer daarnaast een duidelijke werkruimte. Maak deze schoon met desinfectiemiddel. Stel een Bunsenbrander op met een slang die is aangesloten op een gasleiding en zet de benodigde voorraden klaar met correct gelabelde materialen. Ga over tot het grondig wassen van de handen met antiseptische zeep en warm water. Maak eerst de handen nat met warm, stromend water en breng vervolgens zeep aan en verdeel deze grondig. Wrijf krachtig over de handen om wrijving te creëren op alle oppervlakken, inclusief de duimen, de rugzijde van de vingers, de handruggen en onder de nagels. Spoel daarna grondig af om zeepresten te verwijderen en droog af met papieren handdoeken uit een houder. Sluit tot slot de kraan af met een schone papieren handdoek. De uitstrijkprocedure (Streak Plate Procedure) is ontworpen om zuivere culturen van bacteriën, of kolonies, te isoleren uit gemengde populaties door middel van eenvoudige mechanische scheiding. Haal een agarplaat uit een koudebox van 4 °C en laat deze voorverwarmen tot kamertemperatuur. Selecteer een instrument uit het assortiment voor het uitstrijken van de plaat. Zorg ervoor dat de plaat droog is en dat er geen condens op het deksel zit. Label de onderkant van een agarplaat langs de rand. Wanneer men bekwaam is, kan één plaat voor meerdere monsters worden gebruikt. Steek vervolgens een Bunsenbrander aan om de metalen lus te vlammen. Begin drie tot tien centimeter van de metalen lus af met de draad in de punt van de blauwe kegel, het heetste deel van de vlam van de Bunsenbrander. Wanneer het metaal roodgloeiend wordt, beweegt men de draad zodat de vlam de lus nadert. Om de lus af te koelen, raakt men de rand van het agarmedium aan, wat een sissend geluid veroorzaakt. Ga verder door het inoculum met de lus op te nemen. Til de onderste helft van de plaat op. Beweeg de lus heen en weer van de rand naar het midden in het eerste kwadrant van de plaat. Zet de omgekeerde plaat terug op het deksel. Vlam de metalen lus opnieuw. Draai de petrischaal 90 graden. Raak met de lus het einde van de laatste streep aan met behulp van het heen-en-weerpatroon, kruis de laatste helft van de strepen in het eerste kwadrant en beweeg dan naar het lege tweede kwadrant. Zodra het tweede kwadrant is gevuld, zet men de plaat neer. Herhaal de uitstrijkprocedure voor het derde en vierde kwadrant, waarbij contact met het eerste kwadrant wordt vermeden. Voor het uitstrijken met een steriele, platte tandenstoker houdt men het smalle uiteinde voorzichtig tussen de duim en ringvinger in een hoek van 10 tot 20 graden ten opzichte van het medium; gebruik het brede uiteinde om de kwadranten uit te strijken. Keer de plaat tussen de kwadranten door terug op het deksel en voer de tandenstoker op passende wijze af. Ga over tot het incuberen van de uitgestreken platen ondersteboven. De gietplaatprocedure (Pour Plate Procedure) telt het totaal aantal colony forming units op het oppervlak en binnen de agar van een enkele plaat. Zet een timer op 10 minuten en breng vervolgens 18 mL gesmolten agarmedium over van een waterbad van 55 °C naar een heatblock van 48 °C en laat dit 10 minuten equilibreren. Label de onderkant van een steriele petrischaal. Indien van toepassing, vermeld dan de verdunningsfactor. Breng nu één milliliter monster aan in het midden van de petrischaal. Sluit het deksel. Verwijder de dop van de buis met gesmolten agar en haal de rand van de open buis door een vlam. Giet de agar voorzichtig in de petrischaal. Sluit het deksel en meng het monster vervolgens met de agar door de plaat voorzichtig te draaien. Wacht 30 minuten tot de agar is gestold. Zodra de agar is gestold, keert men de plaat om en plaatst men deze in een warme kamer. Spread-plating is erop gericht om micro-organismen in een klein monstervolume te scheiden door de resulterende kolonies gelijkmatig over het agaroppervlak te verspreiden. Equilibreer een plaat naar kamertempering en label deze op passende wijze. Plaats de plaat op de draaischijf. Pipetteer 0,1 mL monster op het midden van de agar en sluit het deksel. Werp de tip in een afvalbak. Dip de metalen staaf in een bekerglas met 70% ethanol, zodat het gehele onderste gedeelte van de spreader en de eerste inch van de steel bedekt zijn, en laat dit vervolgens uitlekken. Ontsteek overtollige ethanol door deze door de vlam van een Bunsenbrander te halen. Open vervolgens het deksel van de agarplaat en koel de spreader af door deze langs de rand van de agar te raken. Draai de draaischijf langzaam. Houd de spreader voorzichtig op het oppervlak van de agar en verspreid het monster geleidelijk en gelijkmatig over de gehele plaat met een heen-en-weergaande beweging terwijl de draaischijf draait. Sluit het deksel en laat het monster ten minste vijf minuten grondig absorberen. Incubeer vervolgens de omgekeerde plaat. Label eerst de agarplaat op passende wijze. Open het deksel van de agarplaat. Open vervolgens de verpakking van gepresteriliseerde glaskralen en vlam de rand. Breng voorzichtig 10 tot 12 steriele glaskralen aan op een agarplaat. Sluit het deksel van de plaat en vlam de rand van de glaskralenverpakking voordat de dop wordt teruggeplaatst. Pipetteer nu het monster op het midden van de agar. Schud de kralen in een horizontale beweging zeven keer voorzichtig over het oppervlak van de agar. Bij een juiste uitvoering klinkt de procedure als het schudden van maraca's. Draai de plaat 60 graden en schud horizontaal opnieuw zeven keer. Draai de plaat opnieuw 60 graden en herhaal het schudden. Verifieer dat het monster is geabsorbeerd. Giet vervolgens de besmette kralen af in een gemarkeerd opvangbekerglas met 10% chloorbleekmiddel. Incubeer de omgekeerde plaat. De plaque-assay wordt veelvuldig gebruikt om bacteriofagen te detecteren en te kwantificeren. Kweek de indicatorbacteriën tot de exponentiële fase en bewaar deze op ijs. Label vervolgens twee steriele microcentrifugebuisjes als 'fage' en 'controle' en voeg respectievelijk 50 µL fagenmonster of buffer toe aan elk buisje. Schud vervolgens de bacteriencultuur in de kolf, breng dan een aliquot bacteriën over naar een steriele buis en vortex de indicatorbacteriën voorzichtig; voeg vervolgens 500 µL bacteriën toe aan elk absorptiebuisje. Meng door voorzichtig tegen de buisjes te tikken. Vortex of pipetteer fagenmonsters nooit krachtig. Incubeer het fage-bacteriemengsel 20 minuten lang bij een temperatuur die geschikt is voor de indicatorstam. Breng ondertussen twee soft agar-buisjes over van een waterbad van 55 °C naar een heating block van 48 °C. Equilibreer gedurende 10 minuten. Label twee condensvrije nutriënt-hard agar-platen die zijn voor-geéquilibreerd naar kamertemperatuur. Haal een soft agar-buisje uit het heating block en controleer of de inhoud niet te warm is om aan te raken. Breng vervolgens aseptisch het mengsel uit het fage-absorptiebuisje over naar het soft agar-buisje. Draai vervolgens snel tussen de handpalmen om de inhoud te mengen. Houd met de buis in één hand het deksel van de hard agar-plaat met de andere hand open. Giet onmiddellijk de gehele inhoud van de buis op het oppervlak van een hard agar-plaat. Beweeg de plaat snel en voorzichtig heen en weer. Sluit het deksel en plaats de plaat 30 minuten op een vlakke ondergrond totdat de soft agar stolt. Herhaal vervolgens de procedure voor het controle-absorptiebuisje door het controlemengsel in een soft agar-buisje over te brengen. Meng dit, giet de inhoud op een hard agar-plaat, beweeg deze heen en weer en laat de soft agar 30 minuten stollen. Inspecteer de platen op plaquevorming. Om een plaque uit een heterogeen mengsel te isoleren, prikt men voorzichtig in het centrum met een steriele tandenstoker en brengt men het inoculum over in een steriele microcentrifugebuis met 100 µL fagenbuffer. Zuiver dit lysaat verder door de plaque-assay drie tot zes keer te herhalen met seriële verdunningen indien nodig. Replica plating maakt gebruik van een selecteerbaar fenotype door de celgroei op een primaire plaat te vergelijken met secundaire platen. Markeer een raster op de onderkant van de plaat, label de primaire plaat en nummer de resulterende vakjes. Gebruik nu een aseptische techniek om een gepresteriliseerde tandenstoker uit het bekerglas te halen, dep het midden van elk vakje met een celmonster en voer de tandenstoker af in een geschikte afvalbak. Incubeer de primaire plaat. Stapel de primaire plaat en alle secundaire platen op. Plaats een oriëntatiemerk op de zijkant van de onderste helft van de platen. Verwijder nu een steriel fluwelen doekje uit de verpakking en plaats dit op het cilindrische blok. Plaats vervolgens de houder, waarbij de markeringen op de houder worden uitgelijnd met die op het blok. Let op het oriëntatiemerk op het blok en de houder. Verwijder vervolgens het deksel van de primaire plaat. Lijn de oriëntatiemerken op de plaat en het blok uit. Laat de plaat zakken zodat het oppervlak van de agar het fluwelen doekje raakt. Druk met de vingertoppen licht maar gelijkmatig op de achterkant van de primaire plaat en til deze vervolgens voorzichtig van het blok af. Bevestig dat de afdruk van de cellen op het fluweel zichtbaar is. Plaats het deksel terug op de plaat. Herhaal nu sequentieel het protocol op het fluwelen doekje met elk van de secundaire platen. Gebruik de fluwelen afdruk van de cellen van de primaire plaat om tot acht secundaire platen te inoculeren, geordend van het minst naar het meest gunstige substraat. Gebruik tot slot als positieve controle voor de laatste plaat in de serie een agarmedium waarin alle geteste stammen zouden moeten groeien. Plak de omgekeerde platen aan elkaar en incubeer ze. Inspecteer de secundaire platen op groei. Zet de Bunsenbrander uit en ruim alle benodigdheden op. Plaats besmet laboratoriummateriaal, glaswerk en gevaarlijk afval in de juiste afvalbak. Maak de werkruimte schoon met desinfectiemiddel. Was tot slot de handen grondig met antiseptische zeep en warm water. Serratia marcescens is een gramnegatieve, staafvormige proteobacterie die een roodachtig pigment produceert genaamd prodigiosine. Het wordt vaak aangetroffen in badkamers en op douchegordijnen. In dit voorbeeld genereert de uitstrijktechniek enkele kolonies in het vierde kwadrant. Deze analyse van bacteriën in een watermonster, verzameld uit een openbare drinkfontein, maakt gebruik van de gietplaattechniek. Let op het verschil in uiterlijk van de kolonies. Oppervlaktekolonies zijn groot en cirkelvormig, terwijl sommige oppervlaktekolonies zeer klein en onregelmatig van vorm zijn. De spread-plate techniek is een belangrijk onderdeel van verrijkings-, selectie- en screeningsexperimenten. De copacabana-methode is bijvoorbeeld een differentiatiemiddel in de klassieke blauw-wit screening bij recombinante DNA-technologie. Faag T4 is een virulente dubbelstrengse DNA-faag die zijn gastheer, zoals Escherichia coli, infecteert om deze te lyseren en nakomelingen van fagen vrij te laten. Deze plaque-assay op EHA-agar toont fagen in heldere zones van ongeveer één millimeter diameter. Bij afwezigheid van infecterende faagdeeltjes resulteert bacteriële groei in een troebele suspensie van cellen in de soft agar, waarin discrete kolonies niet zichtbaar zijn. Bij de soft agar overlay-techniek variëren de plaque-morfologieën. Hier produceert bijvoorbeeld dezelfde mycobacterium-gastheerstam verschillende plaque-morfologieën in de aanwezigheid van mycobacteriën-faag destroyers versus mycobacteriën-faag MSSS. De kracht van replica plating ligt in de gelijktijdige screening van een groot aantal micro-organismen. In dit geval werden vier pseudomonas-stammen in dubbeltoevoeging getest op groei op drie verschillende koolstofbronnen: acetamide, lactose en glycine. Hier is de primaire plaat een compleet YTA-medium, geïnoculeerd met de vier stammen zoals aangegeven. De stammen vertonen variabele groeipatronen op replica-platen van minimaal MSA-medium aangevuld met een enkele koolstofbron: acetamide, lactose of glycine. Alle stammen groeien op de laatste positieve controleplaat, wat bevestigt dat cellen naar alle secundaire platen in deze serie zijn overgebracht. De tabellering van deze replica-plaatresultaten geeft details over de gelijktijdige screening van de verschillende wildtype-stammen voor karakteristieke groeieisen.

- Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u uitplaatprocedures uitvoert zonder media of culturen te contamineren, en hoe u de juiste uitplaatmethode kiest voor elke specifieke experimentele taak in het laboratorium. Het beheersen van deze technieken vereist oefening. Met de juiste training zullen de in deze video beschreven uitplaatprocedures echter een tweede natuur worden tijdens het werken aan de laboratoriumbank.