Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

Het algemene doel van de volgende experimenten is het meten van de mechanische eigenschappen van de interface van de celkern en de fysieke verbinding hiervan met het omringende cytoskelet. Dit wordt bereikt door mechanische rek toe te passen op cellen die zijn geplaatst op een transparant siliconen membraan en door de opgewekte kernvervormingen in beeld te brengen. Toegenomen kernvervormingen komen overeen met een afgenomen stijfheid van de kern, aangezien veranderingen in de koppeling tussen de kern en het cytoskelet eveneens de opgewekte kernvervormingen kunnen beïnvloeden.

Intracellulaire krachtoverdracht tussen het cytoskelet en de nucleus wordt direct onderzocht door gelokaliseerde rek toe te passen op het cytoskelet. De verplaatsing van fluorescentielabelde nucleus- en cytoskeletstructuren wordt vervolgens in beeld gebracht. De resultaten tonen de stijfheid van celkernen aan in verhouding tot het omringende cytoskelet.

Op basis van de experimenten met substraatspanning onthult de micronaaldmanipulatie-assay dat verstoring van de koppeling tussen de celkern en het cytoskelet defecten veroorzaakt in de intracellulaire krachtoverdracht. Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden, zoals micropipet-aspiratie van geïsoleerde kernen, is dat ze metingen van de kernmechanica in intacte levende cellen mogelijk maken zonder de normale cellulaire architectuur te verstoren. Deze methoden kunnen inzicht bieden in hoe veranderingen in de samenstelling van de kernenvelop de mechanische eigenschappen van de kern kunnen beïnvloeden.

Ze kunnen ook worden toegepast om de rol van nucleaire mechanica te bestuderen in de context van ziekten zoals LA-neuropathieën of kanker. Elk rekschaaltje bestaat uit een op maat gemaakt plastic schaaltje zonder bodem met een diameter van drie inch en een plastic O-ring om een siliconen membraan vast te houden, dat dient als substraat voor de celkweek. Voor de bereiding van het rekschaaltje klem je een stuk siliconen membraan van vier inch bij vier inch tussen een O-ring en het schaaltje, snijd je voorzichtig het overtollige membraan weg, spoel je het rekschaaltje met gedeïoniseerd water en autoclaveer je vervolgens het schaaltje voordat het siliconen membraan wordt gecoat met extracellulaire matrixmoleculen; markeer een referentiepunt aan de buitenkant van het membraan in het onderste midden.

Dit referentiepunt helpt bij het identificeren van dezelfde cellen tijdens de rekexperimenten voor de toepassing van axiale rek. Twee parallelle stroken plakband worden rond het referentiepunt aangebracht om de vorming van het membraan in één dimensie te beperken. Om een optimale celhechting te verkrijgen, worden de siliconen membranen gecoat met 3 µg/mL fibronectine of andere geschikte extracellulaire matrixeiwitten.

Dek de zeefschaal af met een omgekeerde polystyreen schaal van 10 centimeter en incubeer deze de volgende dag gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Spoel het membraan één keer met PBS om overtollig eiwit te verwijderen. Vul de schaal met 10 milliliters groeimedium en zet deze opzij.

Zodra de gecoate schaal met siliconen membraan is voorbereid, worden de cellen gedetacheerd met 0,05% trypsine en worden de adherente cellen in groeimedium op de schaal gezaaid. Deze procedure wordt gedemonstreerd met embryonale muiscellen.

Incubeer fibroblasten of mesenchymale cellen gedurende 24 tot 48 uur onder normale kweekcondities. Een omgekeerde microscoop die is uitgerust voor substraatrekexperimenten bevat een rekapparaat bestaande uit een basisplaat die op de objecttafel van de microscoop past. De plaat houdt een centraal cilindrisch platine vast, dat dient om rek aan te brengen op het centrale gedeelte van het siliconenmembraan.

Het apparaat beschikt ook over een beweegbare plaat die de rek-schaal vasthoudt en langs vier geleidingspinnen omhoog en omlaag kan glijden, evenals een gewicht van five pound om een belasting aan te brengen. Om de kernen te visualiseren, worden de cellen in de rek-schaal gedurende 15 minuten bij 37 °C geïncubeerd met één µg/mL hooked stain. Na incubatie wordt het medium afgezogen en vervangen door 15 mL fenolroodvrij groeimedium met 25 mM heis.

Schroef vervolgens de schaal in de schaalhouder en breng voorzichtig vet aan op de rand van de onderkant van het siliconen membraan om te zorgen dat het membraan soepel over het centrale platin glijdt. Zorg ervoor dat het centrale gedeelte van het membraan schoon blijft. Plaats de basisplaat op de objecttafel van de microscoop en monteer de schaalhouder voorzichtig op de basisplaat.

Zorg ervoor dat het siliconen membraan van de rekplaat in de initiële rustpositie losjes op het centrale platine rust. Focus vervolgens op de onderkant van het siliconen membraan en zoek het centrale zwarte referentiepunt. Dit punt dient als startpunt voor alle beeldacquisities en helpt bij het lokaliseren van dezelfde cellen tijdens en na het rekken.

In deze afbeelding vult de centrale stip het volledige gezichtsveld. Pas, beginnend vanaf de rand van de stip, de focus aan om de cellen en de bovenkant van het siliconen membraan te visualiseren. Zoek naar goed uitgespreide cellen met centraal gelegen kernen.

Maak een fasecontrastopname waarbij de focus moet liggen op de celomtrek en het siliconenmembraan. Maak vervolgens een fluorescentie-opname van de nucleaire hook-kleuring, waarbij de focus moet liggen op het centrale vlak van de nucleus. Nadat opnames van vijf tot 15 cellen zijn gemaakt, keert u terug naar het centrale punt.

Breng het gewicht langzaam aan op de rek-schaal om een gelijkmatige rektoepassing te verkrijgen. In het midden van de schaal. De maximaal toegepaste substraatrek wordt beperkt door nylon afstandhouders die op de verticale uitlijningspennen zijn geplaatst. Nadat de rek is aangebracht, richt u op de onderkant van het siliconen membraan en lokaliseert u opnieuw het referentiepunt, beginnend bij het punt.

Verplaats dezelfde cellen en maak opnieuw een fasecontrast- en fluorescentiebeeld van elke celkern onder volledige spanning, waarbij u probeert de brandpuntsvlakken van de initiële beelden zo nauwkeurig mogelijk te benaderen. Dit proces mag niet langer dan 10 minuten duren om actieve remodellering en adaptatie van de cel aan het vreemde substraat te voorkomen. Nadat alle overeenkomstige beelden zijn verkregen, verplaatst u de microscooptafel terug naar het startpunt.

Verwijder voorzichtig het gewicht van de plaat van de schaalhouder en laat het siliconen membraan indien nodig ontspannen. Duw het zeefschaaltje voorzichtig omhoog tot het zich in de beginpositie bevindt. Stel vervolgens het fasecontrast en de fluorescentie in.

Beelden van de cellen na rek, zoals beschreven voor de rekbeelden, en beelden van cellen en fluorescentie-gelabelde kernen vóór, tijdens en na de toepassing van rek, worden geanalyseerd om de genormaliseerde kernrek te berekenen. In deze demonstratie wordt een op maat geschreven MATLAB-script gebruikt voor de analyse, maar er zijn verschillende alternatieve opties beschikbaar om de toegepaste substraatrek handmatig te berekenen door de posities van drie tot zes controlepunten op het membraan tussen de overeenkomstige beelden vóór volledige rek en na rek te matchen. Het MATLAB-programma berekent vervolgens de toegepaste membraanrek door de posities van de overeenkomstige controlepunten tussen de beelden vóór rek en bij volledige rek te vergelijken.

Posities worden ook vergeleken voor de residuele rek tussen de beelden vóór en na de rekbehandeling. De controlepunten worden gelijktijdig gebruikt om de beeldparen te registreren, wat helpt bij het detecteren van beschadigde of loslatende cellen. Selecteer vervolgens handmatig de kernen met behulp van een apart MATLAB-programma dat de nucleaire rek voor elke individuele kern berekent.

Dit wordt bereikt door de kerngrootte tussen overeenkomstige fluorescerende beelden van vóór en na de rek op elkaar af te stemmen, of door intranucleaire markers te matchen om kleine variaties in de aangebrachte membraanrek tussen verschillende experimenten te compenseren. De resultaten worden uitgedrukt als genormaliseerde kernrek. Dit wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de geïnduceerde kernrek en de aangebrachte membraanrek, berekend voor elke kern.

De MATLAB-scripts zijn op aanvraag verkrijgbaar bij het lambing-laboratorium. Als laatste stap wordt elke nucleus gevalideerd en worden metingen van cellen die loslaten of beschadigd raken tijdens het aanbrengen van de rek uitgesloten. MEF's die over twee afzonderlijke gebieden op het siliconemembraan waren verspreid, werden gefotografeerd met fasecontrast- en fluorescentiemicroscopie vóór, tijdens en na het aanbrengen van 20% UNI axiale rek; hier wordt een voorbeeld getoond van een succesvol experiment met valide nuclei van cellen die de rektoepassing zonder beschadiging of loslating hebben overleefd.

In tegenstelling hiermee trokken de hier getoonde cellen samen of raakten ze gedeeltelijk los tijdens het aanbrengen van de rek en zijn ze uitgesloten van de analyse. De cel aan de linkerzijde vertoont tekenen van cytoskeletschade en nucleaire collaps, terwijl de cel aan de rechterzijde gedeeltelijk loslaat en samentrekt tijdens het aanbrengen van de rek. Dit kan een indicatie zijn van overmatige rek.

Hier wordt een analyse getoond van de genormaliseerde nucleaire rek in een panel van verschillende meth-cellijnen van Lamin AC-deficiënte muizen; de cellen brengen ectopisch ofwel een lege vector ofwel wild-type lamin A tot expressie, in vergelijking met meths van wild-type nestgenoten. Verlies van expressie van de eiwitten van de kernenveloppe Lamin AC resulteert in een verhoogde genormaliseerde nucleaire rek. Dit is indicatief voor een afname van de nucleaire stijfheid, die gedeeltelijk of volledig kan worden hersteld door herintroductie van wild-type Lamin A. Ter voorbereiding op het experiment met micronaaldmanipulatie wordt een glazen cellentestschaal van 35 millimeter met een lage concentratie fibronectine gedurende twee uur geïncubeerd bij 37 °C; na incubatie wordt de schaal twee keer gewassen met HBSS en worden twee milliliter groeimedium aan de schaal toegevoegd.

Vervolgens worden muis embryonale fibroblasten getrypsiniseerd met 0,05% trypsine en in groeimedium uitgezaaid op een met fibronectine gecoate glazen bodemschaal in twee milliliter groeimedium. Om enkelvoudige, adherente, niet-confluente cellen te verkrijgen, worden de cellen overnacht teruggeplaatst in de incubator. Om de cellen te kleuren, wordt MitoTracker mitochondriële kleurstof en Hoechst-kernkleurstof aan het groeimedium toegevoegd. Voeg dit groeimedium toe aan de cellen en laat deze vervolgens incuberen.

Was vervolgens de cellen door ze vijf minuten bij kamertemperatuur te incuberen in Hank's gebufferde zoutoplossing. Voeg daarna groeimedium zonder fenolrood met 25 millimol HEPES toe aan de cellen voor beeldvorming.

Plaats voor het micronaaldexperiment een eerder uitgetrokken micronaald in een micromanipulator die is gekoppeld aan een omgekeerde microscoop met een digitale charge-coupled device-camera en focus de micronaald nabij een enkele cel. Maak één afbeelding van de enkele cel voordat de micronaald in het cytoskelet wordt ingebracht.

Maak in fasecontrast één fluorescentiebeeld van de hooks 3 3, 3 4 2-kleuring en één fluorescentiebeeld van de mitochondriale kleuring met een 60 x objectief op een omgekeerde microscoop. Gebruik de micromanipulator om de micronaald zorgvuldig in het cytoplasma van een cel in te brengen op een vaste afstand van de nucleaire periferie en maak één fasecontrastbeeld, één fluorescentiebeeld van de hooks 3 3, 3 4, 2-kleuring en één fluorescentiebeeld van de mitochondriale kleuring. Beweeg de micronaald met een specifieke afstand naar de celperiferie met een snelheid van één micrometer per seconde met behulp van de computergestuurde micromanipulator, terwijl er automatisch elke 10 seconden beelden worden vastgelegd.

Terwijl de micronaald naar een specifieke afstand richting de periferie van de cel beweegt, dient de micromanipulator via een computer te worden aangestuurd om een consistente micromanipulatie te waarborgen. De procedures worden afgesloten met het maken van beelden nadat de micronaald is verwijderd; de beelden van de fluorescentie-gelabelde kenmerken van de nucleus en het cytoskelet, die vóór, tijdens en na de micromanipulatie zijn gemaakt, worden geanalyseerd om de verplaatsing van kleine intracellulaire regio's te berekenen. In deze demonstratie wordt een op maat geschreven MATLAB-script gebruikt voor de analyse, maar er zijn diverse andere opties beschikbaar.

Het MATLAB-script voor het meten van de door de micronaald veroorzaakte verplaatsing is op aanvraag verkrijgbaar bij het lambing-laboratorium. Het MATLAB-programma maakt gebruik van een genormaliseerd cross-correlatiealgoritme om de verschuiving te berekenen tussen de oorspronkelijke locatie van de fluorescentielabel-kenmerken en hun nieuw geïdentificeerde positie. De verplaatsingen worden vervolgens weergegeven als vectorkaarten en opgeslagen als numerieke waarden.

De volgende stap is het gebruik van de resulterende verplaatsingsvectorkaarten om met Matlab de gemiddelde verplaatsingen binnen het cytoskelet of de nucleus te bepalen. Selecteer eerst drie of meer punten binnen het cytoskelet op de plaats waar de rek wordt toegepast. Neem in de verplaatsingsvectorkaart de gemiddelde numerieke waarde om de hoeveelheid cytoskeletale rek nabij de applicatieplaats te bepalen die is gegenereerd tijdens de applicatie van de micronaald.

Select vervolgens drie of meer punten binnen de nucleus nabij de plaats van rektoediening en bereken de gemiddelde waarde. Deze waarde representeert de hoeveelheid nucleaire rek nabij de plaats van toediening van de micronaald. Bepaal met dezelfde methode de nucleaire rek en de rek van het cytoskelet buiten de plaats van rektoediening, op basis van punten die in deze respectievelijke regio's zijn geselecteerd.

Een micronaald-manipulatie-assay werd uitgevoerd om de intracellulaire krachtoverdracht te meten. Hier worden fasecontrastbeelden en fluorescentiebeelden getoond van een fibroblast gelabeld met een blauwe kernkleuring en MIT tracker green mitochondriële kleuring. Een micronaald werd in het cytoskelet ingebracht op een gedefinieerde afstand van de kern en vervolgens in de richting van de celperiferie bewogen.

De mitochondriale verplaatsing werd gevolgd vóór, tijdens en na cytoskeletale spanning, waarna de verplaatsingen als vectoren werden uitgezet. Elke vector vertegenwoordigt de verplaatsing, berekend als de verschuiving tussen de oorspronkelijke locatie en de nieuw geïdentificeerde positie. Gebieden met een lage beeldintensiteit of onvoldoende textuur werden uitgesloten van de analyse.

De cytoskeletale en nucleaire verplaatsing werden vervolgens gekwantificeerd in geselecteerde gebieden op toenemende afstanden van de plek waar de rek werd toegepast, voor zowel controlefibroblasten als fibroblasten. Bij cellen met een intacte nucleo-cytoskeletale koppeling worden krachten door de gehele cel overgedragen, wat resulteert in een geïnduceerde nucleaire en cytoskeletale deformatie die langzaam afneemt naarmate de afstand tot de plek van rektoepassing toeneemt. In contrast hiermee vertonen cellen met een verstoorde nucleo-cytoskeletale koppeling een gelokaliseerde verplaatsing nabij de toepassingsplaats en slechts een geringe geïnduceerde deformatie op grotere afstand.

Vergelijkbare toepassing van cytoskeletale spanning op de plaats van de micronaaldinsertie wordt waargenomen voor zowel controlefibroblasten als fibroblasten met een verstoorde nucleo-cytoskeletale koppeling. De geïnduceerde nucleaire en cytoskeletale verplaatsing in andere regio's was echter significant kleiner in de fibroblasten met een verstoorde nucleo-cytoskeletale koppeling dan in de controlecellen. Een afname in cytoskeletale en nucleaire verplaatsing weg van de plek van spanningsapplicatie wijst dus erop dat de gedwongen transmissie tussen het cytoskelet en de kern was verstoord.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de nucleaire mechanica en de intracellulaire krachtoverdracht tussen de kern en het cytoskelet kunt meten. U kunt deze technieken gebruiken om het effect van mutaties in eiwitten van de kernenvelop of veranderingen in de samenstelling van de kernenvelop te bestuderen die optreden tijdens de ontwikkeling of bij kanker.