Waarom is de co-expressie van MHC-II en CD86 van belang voor targetvalidatie?

Co-expressie van MHC-II en CD86 bevestigt de activering van dendritische cellen na antigeenopname via immuuncomplexen, wat duidt op een functionele capaciteit voor antigenverwerking en -presentatie. Deze dual-marker read-out dient als een functionele biomarker voor het beoordelen van de effecten van immunomodulatoren op de competentie van dendritische cellen in vroege discovery-fasen.

Hoe past de isolatie van immuuncomplexen in de discovery-pipeline?

Het isoleren van tumor-gebonden immunoglobulin G-complexen maakt gestandaardiseerde antigeenlevering aan dendritische cellen mogelijk, waarbij de fagocytose van opsoniseerde tumorcellen wordt gemodelleerd. Deze stap garandeert een consistente beschikbaarheid van antigenen voor opname en verwerking, wat bijdraagt aan reproduceerbare activatiemetingen in screeningscampagnes.

Welke kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen maken het mogelijk om de activatie van dendritische cellen te beoordelen?

Flowcytometrie meet het percentage levende dendritische cellen die MHC-II en CD86 co-expresseren, wat een kwantitatieve readout geeft van de activatiestatus. Deze metriek maakt vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk om de potentie van immunomodulatoren of antigeenformuleringen te evalueren.

Waarom zijn replicatievereisten belangrijk voor cross-functionele samenwerking?

Vastgestelde incubatietijden, antilichaamconcentraties en wasstappen waarborgen de reproduceerbaarheid van de assay tussen verschillende laboratoria en teams. Consistente protocollen maken een betrouwbare data-overdracht mogelijk tussen discovery-, preklinische en translationele groepen voor een gecoördineerde besluitvorming.

Welke statistische analysemogelijkheden zijn vereist vóór implementatie?

De mogelijkheid om de co-expressiefrequenties van MHC-II en CD86 te kwantificeren en de statistische significantie tussen condities te berekenen is essentieel voor de interpretatie van activatiedata. Dit ondersteunt de vergelijkende analyse van de effecten van verbindingen en go/no-go-beslissingen op basis van de effectgrootte en variabiliteit.

Flow Cytometry-Based Analysis of Dendritic Cell Activation Using Immune Complexes

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 weergaven • 3:35 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin with a chemically fixed tumor cell suspension.

Add an optimum concentration of tumor-binding immunoglobulin G that binds to tumor cell surface antigens, forming immune complexes, or ICs.

Transfer the ICs to a culture plate containing adhered dendritic cells. Incubate.

The dendritic cell recognizes the IC, internalizes it, and processes it into peptide fragments.

The fragments are loaded onto major histocompatibility complex class II or MHC-II molecules and presented on the cell surface, along with the costimulatory molecule CD86.

Remove media. Add a cell dissociation buffer and pipette vigorously to detach the cells.

Transfer the cells to a tube.

Centrifuge and resuspend the cells in a blocking solution to block non-specific interactions.

Overlay with a fluorophore-labeled antibody cocktail targeting MHC-II and CD86.

Add a DNA-binding dye and incubate briefly to stain dead cell nuclei.

Using flow cytometry, identify the live cells co-expressing MHC-II and CD86, confirming IC-mediated dendritic cell activation.

First, fix the cells in 1.8% buffered paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature. Seed the cell suspension in each well of a U-shaped 96-well plate. Next, add varying dilutions of tumor-binding antibodies in each well. Thereafter, incubate the cells on ice for 15 to 20 minutes.

After incubation, wash the cells with 150 microliters of phosphate-buffered saline, then centrifuge at 400 times g for 5 to 10 minutes at 4 degrees Celsius. Post-centrifugation, expel the supernatant and wash the cells twice. Dissolve the cells in 100 microliters of FACS buffer, containing fluorophore-conjugated secondary antibody. Next, incubate the plate on ice for 15 to 20 minutes.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

Flow Cytometry-Based Analysis of Dendritic Cell Activation Using Immune Complexes

Overzicht

Belangrijkste componenten van de studie

Wetenschappelijk vakgebied

Achtergrond

Doel van het onderzoek

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële Relevantie voor Management

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege Ontdekking & Targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van pijplijn en workflow

Operationele en zakelijke impact

Overwegingen voor de implementatie

Veelgestelde vragen over Biopharma

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

CD Marker Recognition of Human Cytokine-Induced Killer Cells by Flow Cytometry

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen