Het in kaart brengen Remmende neuronale circuits door Laser Scanning fotostimulatie

Het algemene doel van deze procedure is om de lokale functionele organisatie van remmende neuronale circuits te onderzoeken. De procedure begint met het prepareren van levende hersenplakjes van de primaire somatosensorische cortex van muizen. De volgende stap is het visualiseren en registreren van gerichte GFP-uitdrukkende remmende celtypen in het hersenplakje.

Na deze laser-scannende fotostimulatie via glutamaat wordt uncaging gebruikt om kleine clusters presynaptische neuronen te activeren als exciterend of inhiberend. Postsynaptische stromen worden geregistreerd in de GFP-expresserende interneuronen. De laatste stap bestaat uit fotostimulatie, data-analyse en het genereren van kwantitatieve kaarten van de synaptische input naar de geregistreerde neuronen.

Uiteindelijk maakt laser-scanning fotostimulatie in combinatie met whole-cell registraties de constructie mogelijk van gedetailleerde kaarten van synaptische inputs naar specifieke typen inhiberende neuronen, wat kan helpen bij het bepalen van de organisatie en functie van lokale inhiberende corticale circuits. De techniek op basis van fotostimulatie werd gepionierd door Dr. Larry Katz en Ned Calloway, en verder ontwikkeld door Dr. Carols Waboda, mijn pi, Dr. Xing Z, die is opgeleid bij Dr. Calloway aan het Salk Institute, waar hij vele studies leidde naar interneurale circuitry. Onze groep breidt en vervolgt momenteel deze studies door onderzoek te doen naar interneurale circuits.

Om deze procedure te starten, wordt een transgene muis in de tweede tot derde postnatale week opgeofferd door decapitatie en wordt het brein snel verwijderd en geplaatst in een bevroren en geoxygeneerde snijoplossing. Gebruik vervolgens de GFP-bril om het brein visueel te screenen en de GFP-expressie te controleren. Snijd daarna de primaire somatosensorische cortex met een vibratoom in secties van 400 micrometer dikte.

Incubeer de coupes in de sucrose-bevattende A CSF, gebubbelled met 95%O2 en 5%CO2 bij 32 graden Celsius gedurende 30 minuten tot één uur. Breng de coupes daarna over naar de reguliere A CSF bij kamertemperatuur, terwijl de laser voor het experiment wordt klaargemaakt en het laserkoelsysteem en de voeding worden ingeschakeld. Schakel vervolgens alle hardware in die gerelateerd is aan de besturing van de fotostimulatie, waaronder het scanning-spiegelsysteem, de optische modulator, de elektronische sluiter en een fotodiode-ingangversterker.

Schakel vervolgens de elektrofysiologische apparatuur in, zoals de multi clamp 700 B versterker en de micromanipulatoren. Elektrofysiologische opnames, fotostimulatie en beeldvorming worden uitgevoerd in de perfusiekamer voor coupes, die is gemonteerd op de gemotoriseerde tafel van de microscoop. Zet daarna de beeldvormingscamera aan; de coupe wordt gevisualiseerd in de rechtopstaande microscoop met infrarood DIC en epi-fluorescentie-optiek via het beeldvormingssysteem.

Open vervolgens de MATLAB-gebaseerde FS-software en de Q-capture camera-software op de monitor. Controleer voor het starten van het experiment het lasersimulatiesysteem voor fotostimulatie om er zeker van te zijn dat het in een werkende staat verkeert. Plaats een stuk papier onder de 4x microscoopobjectief om het laserscanpatroon te observeren terwijl het systeem draait.

Om de micro-elektrode met een weerstand van vier tot zes mega Ohm te maken, wordt een glazen elektrode getrokken met de pipettrekker. Vul de elektrode vervolgens met een interne oplossing die 0,1%biotine bevat voor celmarkering en morfologische identificatie. Zet daarna het overdrukperfusiesysteem aan om CSF in de kamer te pompen.

Zorg voor een constant vloeistofniveau van 2,0 millimeter boven de slice in de kamer. Een aliquot van de stockoplossing van MNI caged glutamaat wordt toegevoegd aan 25 milliliters circulerende A CSF voor een concentratie van 0,2 millimolair caged glutamaat. Plaats vervolgens één brenslice in de opnamekamer.

Gebruik het imagingsysteem om de kwaliteit van de coupes te controleren en de primaire somatosensorische area anatomisch te lokaliseren. Veranker vervolgens de coupe met een op maat gemaakte platinaring met draden, en zorg ervoor dat het anker niet over het hersengebied wordt geplaatst dat bedoeld is voor de registratie. Visualiseer de cellen met een 60 x objectief op basis van de visualisatie van GFP-expressie onder een DIC-fluorescentiemicroscoop.

Identificeer en selecteer de inhiberende celtypen. Let op dat de registratie zal plaatsvinden onder visuele controle met behulp van infrarood DIC. Videomonitoren en schakelen tussen de DIC- en fluorescentiemodi is noodzakelijk om de locatie van de GFP-cel te bevestigen terwijl de elektrode naar de doelcel wordt bewogen.

Gebruik de conventionele patch clamp-techniek. Breng eerst een positieve druk aan op de elektrode. Beweeg deze dicht bij het celoppervlak om een duidelijk waarneembare inkeping in het doelcelmembraan te creëren.

Breng vervolgens snel negatieve druk aan om een giga-seal te vormen en penetreer de cel, terwijl de responsen op stroominjectie op de videomonitor worden gevolgd. Maak na het penetreren beelden van het geregistreerde GFP-expresserende neuron bij een 60 x vergroting in de DIC- en fluorescentiemodi voor online verificatie. Voordat de fotostimulatiegegevens worden verzameld, worden hyperpolariserende en depolariserende stroompulsen geïnjecteerd om de basis-elektrofysiologische eigenschappen van elke cel te onderzoeken.

Zodra de situatie stabiel is en een whole-cell registratie is behaald met een goede toegangsweerstand, die gewoonlijk minder dan 20 mega ohms bedraagt, wordt het objectief van de microscoop gewisseld van 60 x naar vier x vergroting voor laser-scanning fotostimulatie; maak een afbeelding van het snede-preparaat bij vier x vergroting en gebruik deze voor het geleiden en registreren van de fotostimulatieplaatsen. Stel de parameters voor fotostimulatie en data-acquisitie in door het configuratieschakelmodule van phys te activeren. Gebruik een laserpuls van één milliseconde van ongeveer 20 milliwatt met een stimulusinterval van één seconde.

Voor fotostimulatie-mapping worden datasporen van één seconde verzameld, gesampled op 10 kilohertz. Laad vervolgens de 4x slice-afbeelding in de mapper-module van phys. Definieer de locatie van het soma en stel de fotostimulatieplaatsen in volgens een patroon van 16 bij 16 met een afmeting van 80 µm bij 80 µm.

Spatiering rondom de locatie van de cel, die alle corticale lagen beslaat. Breng vervolgens het excitatieprofiel van het geregistreerde neuron in kaart door de spiking-locaties te onderzoeken in reactie op fotostimulatie in de current clamp-modus. Onze gebruiksvriendelijke software met online weergavefuncties vergemakkelijkt de mapping-experimenten.

Breng daarna de verbindingen van het lokale excitatoire circuit in kaart door de excitatoire postsynaptische stromen van de geregistreerde cel te detecteren. Houd bij laserscanning op verschillende locaties de cel op negatief 70 millivolt in voltage-clampmodus om binnenwaartse excitatoire stromen te detecteren. Herhaal vervolgens de kaarten van de excitatoire postsynaptische stromen twee tot drie keer, waarbij het fotostimulatiepatroon wordt geroteerd of gespiegeld. Om de verbindingen van het lokale inhibitoire circuit in kaart te brengen, worden de inhibitoire postsynaptische stromen van de geregistreerde cel gedetecteerd.

Houd de cel in dit geval op bijna nul millivolt, specifiek op negatief 15 millivolt in voltage clamp-modus, om uitwaartse inhiberende stromingen te detecteren. Verwijder na voltooiing van alle fysiologische assays de elektrode voorzichtig uit de geregistreerde cel. Haal de hersensectie uit de kamer, fixeer deze vervolgens gedurende één nacht in 4% paraformaldehyde en kleur de geregistreerde cellen tegen biotin.

In dit experiment wordt de combinatie van GFP-expressie, intrinsieke elektrofysiologie en morfologische kenmerken gebruikt om de inhiberende neuronen te classificeren. Hier worden een voorbeeld en een kaart met ruwe gegevens getoond om de laser-scan fotostimulatie te illustreren, waarmee uitgebreide mapping van lokale corticale circuitverbindingen met het geregistreerde inhiberende neuron mogelijk is. Hier zijn voorbeelden van de kleurgecodeerde kwantitatieve inputkaarten, afgeleid van de ruwe sporen die zojuist in Figuur D werden getoond. De amplitudes van de synaptische gebeurtenissen die in het geregistreerde interneuron zijn gedetecteerd, zijn kleurgecodeerd en topografisch geprojecteerd op de locaties van de fotostimulatie.

De locatie van het cellichaam wordt aangegeven door de rode open cirkel in de schaalbalk. De warme kleuren duiden sterke synaptische inputs aan en koele kleuren duiden zwakke of geen connectiviteit met de doelcel aan. Evenzo presenteert figuur E het aantal synaptische events per bemonsterde uncaging-locatie naar het geregistreerde neuron.

Figuur F demonstreert de onsettijd van het eerste gedetecteerde synaptische event in de geregistreerde cel na fotostimulatie in de schaalbalk. De warme kleuren duiden op een korte inputlatentie en koelere kleuren duiden op langere synaptische latenties. LSPS maakt hiermee de constructie mogelijk van gedetailleerde kaarten van de positie, sterkte, latentie en het aantal inputs dat inwerkt op specifieke typen inhiberende neuronen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om geduldig te zijn, voor schone experimentele condities te zorgen en de neuronen zeer zorgvuldig te behandelen bij het overschakelen van een hoge naar een lage vergroting. Gebruik tot slot de software op een correcte wijze.