Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Het algemene doel van het volgende experiment is het creëren van cellulaire micro-omgevingen om biologische vraagstukken te bestuderen met betrekking tot individueel en collectief celgedrag dat plaatsvindt op micro- en nanoschaal. Dit wordt bereikt door eerst templates te ontwerpen die uiteindelijk de plaatsing van cellen zullen sturen. Vervolgens worden deze ontwerpen via fotolithografie vertaald naar patroonoppervlakken, wat de creatie van plasma-afschermingsmallen via soft-lithografie mogelijk maakt.

Ten slotte worden deze afschermmalen als een driepoot in een Petrischaal geplaatst om selectieve blootstelling van de onderliggende oppervlakken aan plasma mogelijk te maken, waardoor er op de gebieden onder elke mal een celgevoelig chemisch patroon ontstaat. Hiermee kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe het gedrag van een cel afhangt van de micro-omgeving en de interactie met naburige cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de effecten van micro-omgevingen op het celgedrag, zoals de vraag hoe interacties tussen groepen cellen invloed hebben op fenomenen van hogere orde.

En hoe beïnvloeden subcellulaire cues op nanoschaal functies zoals gezonde migratie en differentiatie? Gebruik eerst secondelijm om een patroonglasplaatje aan een stapel lege objectglazen te bevestigen. Maak vervolgens een bakje van aluminiumfolie dat iets groter is dan de stapel glasplaatjes en groot genoeg is om 30 gram polydimethylsiloxaan of PDMS te bevatten.

Plaats de stapel objectglazen in de houder en giet vervolgens PDMS over de stapel objectglazen om een initiële mal te maken. Ontgas het PDMS door de houder in een vacuümkamer te plaatsen. Verwijder eventuele luchtbellen in het PDMS door een vinger meerdere keren snel van en op de slang van de inlaatklep te plaatsen, zodat er kortstondig lucht de kamer in kan stromen.

Het ventiel wordt vijf minuten gesloten voor ononderbroken ontgassing. Laat het PDMS vervolgens één tot twee dagen uitharden in de cleanflow-kast bij kamertemperatuur. Zodra het is uitgehard, wordt het PDMS van het masterpatroon afgepeld, waardoor er een mal ontstaat.

Giet vervolgens een dunne laag van zes gram twee-componenten epoxy, die zojuist gedurende één minuut is gemengd, in de mastermal. Ontgas de epoxy onmiddellijk met behulp van meerdere bellenbrekende cycli voordat de epoxy uithardt. Nadat de ontgaste epoxy een uur ongestoord heeft kunnen rusten, zal deze gedeeltelijk uitgehard zijn.

Voeg meer epoxy toe aan de mal zonder te ontgassen om een dikkere structuur te verkrijgen die in latere stappen gemakkelijker hanteerbaar is. Laat de epoxy vervolgens één tot twee dagen uitharden. Zodra de epoxy-mal is uitgehard, wordt de epoxy uit de PDMS-moedermal verwijderd en wordt er tape om de epoxy-mal gewikkeld om een houder te vormen.

Een werkmal kan vervolgens worden gemaakt door PDMS op de epoxy-mal te gieten, het PDMS te ontgassen en de nieuwe mal één tot twee dagen te laten uitharden. Zodra de werkmal is uitgehard, wordt de mal van de epoxy gepeld en worden beide in petrischalen in een afgesloten plastic container in de laminaire flowkast bewaard om de reinheid te waarborgen. Om een mal voor oppervlaktepatronering voor te bereiden, worden kleine secties van de werkmal met een scheermesje uitgesneden en in een petrischaal geplaatst.

De posities van deze malsecties worden op de achterzijde van de Petrischaal gemarkeerd met een watervaste stift door een omtrek te tekenen rond de plek waar de malsecties liggen; vorm een driepoot met de secties en laat de driepoot rusten om een conform contact tussen de werkmal en het oppervlak van de Petrischaal te garanderen. Bekijk de bodem van de schaal om een goede plaatsing te bevestigen, wat blijkt uit de aanwezigheid van kanalen die met het blote oog of met een kleine vergrootglas zichtbaar zijn. Plaats de assemblage in een plasmakamer.

Start de plasmabehandeling na de plasmabehandeling. Verwijder de mal en de gewichtenopstelling en plaats de Petrischaal gedurende 10 minuten onder UV-licht in een veiligheidskast voor sterilisatie. Bewaar de schaal daar totdat deze met cellen wordt gezaaid.

Verdun de gekozen experimentele cellen in hun standaard kweekmedium om de gewenste confluentie te bereiken. Giet drie milliliters van de celoplossing in de gepatroonde Petrischaal zodra deze op het oppervlak is geplaatst. Incubeer de gepatroonde Petrischaal bij 37 °C, 5% CO2 en 100% vochtigheid gedurende enkele uren tot enkele dagen om de cellen toe te staan zich te assembleren op het patroon dat door de plasmacel is gecreëerd.

Het patroon wordt gecontroleerd met fasecontrastmicroscopie. Voeg bij het kweken van neuroblastoomcellen dagelijks 10 micromolair retinoïnezuur toe totdat celdifferentiatie naar een neuron-achtige status wordt waargenomen. Vervang het standaard celkweekmedium elke drie tot vier dagen.

Een typisch resultaat van de implementatie van de plasmalithografietechniek is de vorming van een celpatroon dat lijkt op een willekeurige of natuurlijke structuur. Een voorbeeld hiervan is hier in deze figuur te zien met neuronen die zijn gedifferentieerd met retinoïnezuur op een patroon van lijnen. En hier in deze figuur, waar lijnen en netwerken van neuronen zijn gecreëerd; andere celtypen dan neuronen kunnen ook worden gebruikt, zoals te zien is in de volgende twee figuren: deze figuur toont endotheelcellen van de menselijke navelstrengvene en deze figuur toont C2C12 skeletspiercellen die rasters vormen, zoals hier te zien is.

Materialen zoals polylysine kunnen ook in patronen worden aangebracht om de hechting van bepaalde celtypen te vergemakkelijken en voor andere toepassingen. Na deze procedure kunnen aanvullende elementen worden geïntegreerd, zoals microfluidica, celonderzoek of genetische manipulatie van specifieke eiwitten, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals op welke wijze combinaties van stimuli het gedrag van individuele cellen en cellen in hogere orde beïnvloeden.