Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio's voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling
13 november 2011
RNA-expressieprofilering van specifieke hersenregio's bij muizen vereist een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. Hier wordt een protocol beschreven dat gebruikmaakt van zowel coronale hersensecties als microdissectie met behulp van een weefselpons. De opbrengst en kwaliteit van het totale RNA dat uit de resulterende monsters is verkregen, bevestigen het nut van de beschreven methode.
Het algemene doel van deze procedure is om op een reproduceerbare, consistente, kostenefficiënte en RNAase-vrije manier totaal RNA te isoleren uit specifieke hersenkernen. Dit wordt bereikt door eerst een RNAase-vrije werkomgeving voor te bereiden en de volledige hersenen te verwijderen uit een gedecapiteerde muis. Vervolgens wordt een micrometer-gestuurde weefselsnijder gebruikt om seriële weefselcoupes van uniforme grootte te snijden.
Vervolgens worden de relevante hersengebieden gemicrodissecteerd met behulp van een weefselkern met een vaste diameter, terwijl het weefsel in een RNA-vrije mediumomgeving wordt gehouden. Tot slot wordt het totaal RNA geïsoleerd uit de uitgesneden hersenkernen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een voldoende opbrengst en kwaliteit van totaal RNA aantonen voor de daaropvolgende cDNA-bibliotheekpreparatie en transcriptoomprofilering via spectrofotometrische of fluorometrische analyses.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals grove anatomische dissectie of laser-capture microscopie-ondersteunde excisie van hersengebieden, is dat meerdere afzonderlijke hersengebieden van belang op een reproduceerbare en kostenefficiënte manier uit één individuele muizenhersenen kunnen worden verzameld. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen, zoals de vraag of verschillende transcriptie-expressieprofielen binnen hersengebieden die niet aan neuronale circuits zijn gekoppeld, gecorreleerd kunnen zijn met bepaalde gedragskenmerken, omgevingsreacties en/of ziektebeelden. Ter voorbereiding op de microdissectie wordt 100 milliliters Earl's gebalanceerde zoutoplossing of EBSS aangevuld met 0,44 grams natriumbicarbonaat en 0,884 grams glucose.
Behandel de EBSS met 0,1 milliliters DEPC in een autoclaafbestendige fles of kolf met schroefdop gedurende ten minste 12 uur bij 37 degrees Celsius. Plaats glazen pipetten van five and three quarter inches in een glazen bekerglas van een liter en plaats kunstpenselen met de haren naar boven gericht in een glazen maatcilinder van 100 milliliters.
Voeg voldoende met DEPC behandelde wateroplossing toe om de pipetten en borstels te bedekken. Dek het bekerglas en de maatcilinder af met aluminiumfolie en incubeer gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C. Verhit na de incubatie van 12 uur met DEPC alle met DEPC behandelde materialen tot een temperatuur boven de 100 °C gedurende ten minste 15 minuten. Laat de EBSS afkoelen tot kamertemperatuur voordat deze wordt bewaard bij 4 °C.
Giet de DD H2O uit het bekerglas en de maatcilinder en blijf deze incuberen bij een temperatuur van meer dan 100 °C totdat de materialen droog zijn. Haal ze uit de incubator, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar ze voor later gebruik. Behandel op de dag van het experiment alle werkvlakken om RNA-contaminatie te verwijderen; plaats en houd de EBSS in een waterbad ingesteld op 40 °C om deze te bufferen en te oxygeneren.
Verzadig het EBSS met 5% CO2 en 95% zuurstof door gasleidingen in een RNA-vrije Pasteurpipet te plaatsen. Steek de pipet in het EBSS en sluit de opening van de EBSS-container af. Stel een weefselsnijder in voor seriële sectieering van het hersenweefsel.
Behandel de boven- en onderzijde van de weefselsnijder. Om RNA-contaminatie te verwijderen, brengt u een rechthoekig stuk Watman nummer 4 filterpapier aan op het plexiglas oppervlak van de weefselsnijder. Bevestig een tweesnijdend scheermesje aan de snijarm.
Stel de micrometer in op nul en pas de minimale hoogte van de chopper-arm aan zodat het scheermes het filterpapier snijdt, maar niet de plexiglasplaat. Verzamel alle aanvullende materialen die nodig zijn voor de microdissectie, waaronder RNA-vrije celluurschalen van 60 bij 15 millimeter, weefselcos 200 µL RNA-vrije micropipetpunten, gebogen scharen, droogijs en buisjes voor weefselverzameling. Plaats de buisjes op droogijs nadat een muis is gedecapiteerd met een knaagdierguillotine en de volledige hersenen, met zowel de achterhersenen als de oogzenuwen intact, zijn verwijderd.
Plaats de hersenen in een RNase-vrije celkweekschaal van 60 bij 15 millimeter. Verplaats deze vervolgens naar het werkoppervlak voor weefselbemonstering. Gebruik een RNase-vrije pipet om het filterpapier dat aan de weefselhakker is bevestigd voorzichtig te bevochtigen met EBSS.
Bevochtige het hersenweefsel met EBSS. Plaats de hersenen in de weefselhakker en positioneer deze zodanig dat het ventrale oppervlak op het filterpapier rust. De middellijn moet loodrecht op het mes van de hakker staan en de rostrale rand van de hersenen moet het mes raken.
Gebruik een met A-D-E-P-C behandelde penseel om de hersenen stationair te houden door zachte druk uit te oefenen op het dorsale oppervlak van de hersenen. Til de hendel van de meshouder ongeveer vier tot vijf centimeter boven het dorsale weefseloppervlak op en houd deze in deze positie. Verwijder het penseel van het hersenoppervlak en stel de schijf in op 750 micrometers.
Gebruik de micrometer. Laat de hendel zakken zodat het weefsel wordt gesneden en er een coronale sectie van 750 micrometer ontstaat, terwijl het snijblad stationair blijft. Gebruik een rollende beweging met het penseel om de weefselsectie voorzichtig van het blade-oppervlak weg te vegen.
Plaats de weefselcoupe onmiddellijk in de geoxygeneerde EBSS in de Petrischaal. Deze plak is nu gereed voor microdissectie. Herhaal de snijprocedure totdat seriële hersencoupes over het gehele rostrocaudale vlak zijn verkregen om de microdissectie uit te voeren.
Controleer eerst de verlichting om er zeker van te zijn dat de belichting van het monster niet wordt belemmerd. Pas de positie en de stroom van het O2 CO2-mengsel aan om een gebufferde, zuurstofrijke omgeving voor het weefsel te handhaven. Identificeer tijdens de procedure de coronale hersensectie die het interessegebied bevat en plaats deze met behulp van een penseel plat op de bodem van de Petrischaal.
Selecteer de weefselpons met de juiste diameter. Houd de coronale weefselcoupe op zijn plaats met het penseel en breng de snijpunt van de weefselpons naar het oppervlak van de weefselcoupe. Oefen druk uit en duw de punt van de weefselpons door de weefselcoupe heen, stevig tot op de bodem van de Petrischaal.
Gebruik een rollende cirkelvormige beweging om er zeker van te zijn dat het gebied van interesse is gescheiden van het omringende weefsel. Til de weefselkern voorzichtig weg van de weefselcoupe en bevrijd de micropunch met behulp van een kunstenaarspenseel, zodat deze in de EBSS kan drijven. Plaats de weefselmicropunch onmiddellijk in een buisje voor stabiele opslag bij -80 °C dat op droogijs is bewaard.
Het weefsel moet gemakkelijk aan de wand van de buis hechten. Plaats de buis met het microdissectie-monster terug in het droogijs. Herhaal deze microdissectie voor elk hersengebied van belang.
Zodra de microdissectie is voltooid, noteert u het respectievelijke label of de barcodes voor elke monsterbuis. Plaats de weefselmonsters in een vriezer van -80 °C tot aan de RNA-extractie om RNA uit de weefselmonsters te extraheren. Bereid eerst een RNA-vrije werkruimte voor.
Maak een voldoende hoeveelheid magnetische kraalmix en lysis-bindingsoplossing zoals beschreven in de handleiding van de totale RNA-isolatiekit. Haal de weefselmonsters uit de vriezer van -80 °C en plaats de buisjes direct op droogijs. Voeg 100 µL van de lysis-bindingsoplossing toe aan een buisje met monster.
Bevestig een nuclease-vrije stamper voor buisjes van 0,5 milliliter aan de pelletmixer en homogeniseer het weefsel met een nuclease-vrije pipetpunt met lage retentie. Draag het gehomogeniseerde monster onmiddellijk over naar een putje op een ronde bodem 96-wells weefselkweekplaat met behulp van hetzelfde type punt. Voeg 60 microliters 100% isopropanol toe aan het monster.
Voeg 20 µL van het kraalmengsel toe aan het monster en meng door drie tot vier keer op en neer te pipetteren. Volg de stappen van het protocol van de total RNA-isolatiekit om de extractie van totaal RNA te voltooien. Meet tot slot de zuiverheid en concentratie van het resulterende totaal RNA. De gegevens van totaal RNA uit micropunches van verschillende hersengebieden worden in deze tabel weergegeven.
RNA-monsters opgelost in 30 µL elutiebuffer leverden voldoende totaal RNA op voor gebruik met commercieel verkrijgbare cDNA-preparatieproducten voor RNA-sequencingtoepassingen. Daarnaast zijn de RNA-opbrengst en de 260/280-ratio's enkelvoudige waarden verkregen uit respectievelijke microdissectiemonsters om de metingen van elke hersenregio aan te tonen, en zij bevestigen een hoge zuiverheid van de monsters. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 8 tot 10 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om het risico op RNA-contaminatie van werkvlakken of weefselmonsters te minimaliseren door uitsluitend RNA-vrije of DEPC-behandelde materialen te gebruiken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor RNA-expressieprofilering in specifieke hersenregio's van muizen, met de nadruk op een nauwkeurige en reproduceerbare strategie voor weefselverzameling. De methode combineert coronale hersensecties met microdissectie met behulp van een weefselstanser om totaal RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Moleculaire biologie
- RNA-profilering
Achtergrond
- RNA-expressieprofilering is cruciaal voor het begrijpen van de hersenfunctie.
- Discrete hersenkernen vereisen een zorgvuldige dissectie voor een nauwkeurige analyse.
- Het handhaven van een RNase-vrije omgeving is essentieel voor de integriteit van het RNA.
- Eerdere methoden verdienden het aan consistentie en reproduceerbaarheid.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol vast te stellen voor RNA-extractie uit hersengebieden van muizen.
- Om een hoog rendement en een hoge kwaliteit van RNA te waarborgen voor downstream applicaties.
- Om transcriptoomprofilering te faciliteren door verbeterde methoden voor weefselcollectie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een RNase-vrije werkomgeving.
- Decapitatie en verwijdering van de gehele hersenen van de muis.
- Uniform snijden van hersenweefsel met een micrometer-gestuurde weefselsnijder.
- Microdissectie van doelgerichte hersengebieden met gebruik van een weefselkern in een RNA-vrij medium.
Belangrijkste resultaten
- Een hoge opbrengst aan totaal RNA werd verkregen uit de gedissecteerde hersenkerne.
- De kwaliteit van het RNA werd bevestigd als geschikt voor de preparatie van een cDNA-bibliotheek.
- De resultaten ondersteunen de bruikbaarheid van de methode voor transcriptoomprofilering.
- Analyses toonden aan dat de RNA-kwaliteit voldoende was voor downstream toepassingen.
Conclusies
- Het beschreven protocol biedt een betrouwbare aanpak voor RNA-extractie.
- Het verbetert de consistentie en kwaliteit van RNA-monsters uit hersengebieden van muizen.
- Deze methode is nuttig voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek waarbij RNA-analyse betrokken is.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze microdissectieaanpak maakt een reproduceerbare isolatie van totaal RNA met een hoog rendement mogelijk uit specifieke hersengebieden van muizen, waardoor een belangrijk knelpunt bij de validatie van targets in de neurowetenschappen wordt weggenomen, waar lage RNA-opbrengsten uit laser capture microscopy transcriptoomprofilering belemmeren. Door een consistente RNA-kwaliteit te leveren die geschikt is voor next-generation sequencing, ondersteunt de methode het mechanische de-risking van CNS-targets en verbetert ze het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-workflows. Het positioneert zich als een schaalbaar, kostenefficiënt alternatief voor genexpressiestudies in specifieke hersengebieden bij preklinische targetbeoordeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door RNA te isoleren uit specifieke hersenkernen, om zo transcriptexpressie te correleren met de functie van neuronale circuits en gedragstypische fenotypes.
- Operationele waarde: Maakt herhaalbare en kostenefficiënte monsterafname mogelijk uit meerdere afzonderlijke regio's per muis, waardoor het aantal gebruikte dieren wordt verminderd en de doorvoer voor risicoreductie van targets wordt verhoogd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert totaal RNA met voldoende opbrengst en zuiverheid voor downstream RNA-Seq en qRT-PCR, wat een betrouwbare assay-ontwikkeling mogelijk maakt voor genexpressie-screening in hersenweefselmodellen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van RNA-isolatie met magnetische beads die compatibel is met high-throughput workflows, wat standaardisatie over screeningcampagnes heen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert ziekterelevante transcriptomische profilering in muismodellen, wat aansluit bij translationele inspanningen voor de ontdekking van biomarkers bij neuropsychiatrische en neurodegeneratieve aandoeningen.
- Operationele waarde: Waarborgt de RNA-integriteit door RNase-vrije protocollen, waardoor de reproduceerbaarheid in longitudinale preklinische studies en de vergelijkbaarheid van gegevens tussen laboratoria wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen tot aan de identificatie van lead-verbindingen, waarbij nauwkeurige RNA-profilering van hersengebieden de selectie en prioritering van doelwitten ondersteunt voorafgaand aan de preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalroutes en biologische risicoreductie door transcriptomische vergelijkingen mogelijk te maken tussen verschillende hersengebieden die gekoppeld zijn aan specifieke neurale circuits.
- Screening: Levert gestandaardiseerde RNA-inputs die geschikt zijn voor kwantitatieve screening van genexpressie, wat de reproduceerbaarheid in target engagement-assays verbetert.
- Analytics: Genereert hoogwaardig RNA voor spectrofotometrische en fluorometrische kwantificering, waardoor nauwkeurige input-normalisatie mogelijk wordt voor sequencing en PCR-gebaseerde toepassingen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt expressieprofilering in de ontdekkingsfase met preklinische continuïteit door ziekterelevante transcriptomische gegevens te leveren uit gedefinieerde hersengebieden.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselcollectie en RNA-isolatie dat toepasbaar is op meerdere neurowetenschappelijke projecten en target-klassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit te verminderen via nauwkeurige expressiegegevens die specifiek zijn voor hersengebieden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via RNase-vrije workflows en minimale handmatige verwerkingstijd (8–10 minuten per monster).
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van meerdere regionale monsters uit één dier, waardoor de kosten verbonden aan methoden met een lage opbrengst die amplificatie vereisen, worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde targetprioritering door betrouwbare transcriptoomgegevens te leveren voor go/no-go-beslissingen bij het ontdekken van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel (CNS).
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuroanatomie en RNase-vrije technieken om de integriteit van de monsters tijdens dissectie en RNA-extractie te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot een micrometer-gestuurde weefselhakker, weefselponsjes met een vaste diameter en RNA-isolatiekits op basis van magnetische beads.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor een RNase-vrije omgeving binnen teams om consistentie in de RNA-kwaliteit tussen verschillende studies te garanderen.
- Aanpassing naar andere hersengebieden of soorten kan optimalisatie van de diameter van de weefselponsjes en de doorsnedeparameters vereisen.
- Praktische beperking: Handmatig weefselponsen kan de ultra-high-throughput toepassingen beperken in vergelijking met geautomatiseerde laser capture-systemen, hoewel het een superieure RNA-opbrengst biedt.
