Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

Het algemene doel van dit experiment is om het denguevirus fluorescent te labelen voor microscopische studies. Bereid de benodigde buffers voor en zuiver het denguevirus met een sucrosekussen; reconstitueer de Amy React Alexa flow-kleurstof en het denguevirus in labelingsbuffer. Label het denguevirus met honderd micromolair Alexa flow.

Incubeer gedurende één uur en stop de labelingsreactie met het sub-reagens. Zuiver het gelabelde denguevirus via een grootte-uitsluitingskolom. Titreer het gelabelde virus opnieuw met een plaque-assay en schat de graad van labeling via een immunofluorescentie-assay.

Hallo, ik ben Sam Jang van de DSO National Laboratories, werkzaam in het lab van Dr. Wee binnen het programma voor opkomende infectieziekten na mijn studie aan de NUS graduate medical school. Vandaag ga ik u laten zien hoe u het Denki-virus fluorescent kunt labelen met een amino-reactieve Alexa flu-kleurstof voor beeldvormingsstudies. Alexa flu-kleurstoffen hebben een superieure stabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan veelvoorkomende kleurstoffen zoals fluoresceïne en rhodamine, waardoor ze ideaal zijn voor studies naar de cellulaire opname en het endosomale transport van het virus.

Alexa-gelabeld denguevirus zal het begrip van de pathogenese van dengue faciliteren. Laten we beginnen. Bereid vóór de labelingsreactie verse labelingsbuffer en stop-reagens voor volgens het schriftelijke protocol en zuiver het denguevirus via een sucrosekussen; voeg een geschikt volume van het gezuiverde denguevirus toe aan de labelingsbuffer in een microcentrifugebuisje om een concentratie van 300 miljoen forming units per milliliter te bereiken.

Dit kan proportioneel worden opgeschaald. Voor batchlabeling van het virus: reconstitueer de geliofiliseerde Alexa-kleurstof tot een concentratie van 1 mM in labelingsbuffer vlak voor de labelingsreactie.

Minimaliseer vanaf deze stap de blootstelling aan licht. Ten behoeve van de demonstratie zal de Alexa-stroomkleurstof onbeschermd tegen licht blijven. Voeg 800 µL van de 1 mM Alexa-stroomkleurstof toe aan het verdunde denguevirus, terwijl u voorzichtig roert met de tip van de micropipet.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, waarbij elke 15 minuten voorzichtig wordt gemengd door inversie. Centrifugeer de buisjes na één uur kort. Neem 800 µL van de subregio op terwijl er voorzichtig wordt geroerd met de micropipet; incubeer vervolgens nog een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, waarbij elke 15 minuten voorzichtig wordt gemengd door inversie.

Equaliseer ondertussen de zuiveringskolom met 25 milliliters HNE-buffer. Breng na de incubatie van één uur het gelabelde virus aan op de kolom en begin met het opvangen van de doorloop. Vul de kolom met HNE-buffer.

Zodra al het gelabelde virus in de matrix is geïntroduceerd, wordt de eerste 2,5 milliliters van het doorstroomvolume weggegooid en worden de volgende twee milliliters van de gelabelde virusfractie opgevangen. Vries het gezuiverde gelabelde virus in bij -80 °C. Bepaal de titer van het gelabelde virus via een plaque-assay.

In een typisch experiment mag een daling van de virustiter van minder dan tienvoudig worden waargenomen. Na de labeling dient een immunofluorescentie-assay te worden uitgevoerd om de graad van labeling te evalueren. Hiervoor moeten de virale cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer en moet een passend volume cellen aan groeimedium worden toegevoegd om een dichtheid van 50.000 cellen per milliliter te bereiken.

Voeg één milliliter virale cellen per put toe aan een vierputjesplaat met een steriel glazen dekglas. Incubeer de cellen overnight bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Haal de plaat uit de incubator en aspireer het supernatant uit de put; behandel de cellen vervolgens met ongeveer één MOI van het gelabelde virus in een volume van honderd µL gedurende 10 minuten bij 37 °C.

Verwijder het inoculum en was de cellen met 0,5 milliliters PBS-buffer per putje. Herhaal deze procedure nog twee keer. Fixeer de cellen met 200 microliters 3% per multi height per putje bij kamertemperatuur gedurende 30 Minutes.

Was de cellen drie keer met 0,5 milliliters PBS-buffer per well. Fixeer de cellen met fixatie-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 Minutes. Verwijder het dekglas uit de well met een fijne pincet.

Drain het overtollige vloeistof door de rand van het dekglas weg te trekken. Schuif het tegen een wit stuk papier. Plaats de cellzijde van het dekglas.

Breng 25 µL dengue e-proteïne antilichaam aan op een dekglasplaatje. Incubeer gedurende één uur in een bevochtigingskamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verplaats vervolgens het dekglasplaatje naar een six-well plaat en voeg twee mL wasbuffer per putje toe.

Zuig het supernatant af. Herhaal deze wasstappen nog twee keer na de laatste wasbeurt. Verwijder het dekglas uit de put met een fijne pincet.

Laat het overtollige vocht weglopen door de rand van het dekglas aan te raken. Absorbeer het vocht met een papieren wisdoek. Plaats het dekglas op de celzijde.

Breng 25 µL Alexa Fluor 488 anti-muis secundair antilichaam aan op een dekglasje. Incubeer gedurende 45 minuten in een vochtige kamer bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Nadat de incubatie is voltooid, brengt u het dekglasje over naar een 6-wellplaat en wast u de cellen drie keer met 2 mL wasbuffer per wasbeurt. Verwijder na de laatste wasbeurt het dekglasje uit de well en spoel het één keer af met gedeïoniseerd water.

Klap het overtollige vloeistof weg door het tegen een papier te drukken. Bevestig het dekglas op een microscoopglaasje met acht µL milde monteermiddel. Laat het monteermiddel een nacht uitharden in de lucht bij vier °C.

Het monster is nu klaar om gevisualiseerd te worden met een fluorescentie- of confocale microscoop. Plaats een kleine druppel immersie-olie op het oppervlak van het dekglas en bevestig de microscoopdia door deze op de objecttafel te klemmen.

Stel de tafel zo in dat het objectief van de microscoop in contact komt met de immersie-olie. Voor een helder beeld schakelt u de omgevingsverlichting uit met de Zes Zen-software. Klik op het tabblad 'ocular' voor directe observatie van het monster via het oculair van de microscoop.

Zoek een veld met cellen en stel de focus in. Schakel nu over naar de acquisitiemodus. Om crosstalk tussen fluorescerende kanalen te minimaliseren, selecteert u afzonderlijke tracks voor Alexa Fluor 488 en DAPI.

Stel de kleurstoffen en acquisitie-instellingen in voor sequentiële excitatie en detectie. Pas de laservermogensversterking en offset aan om ervoor te zorgen dat het beeld niet over- of onderbelicht is. Leg het beeld vast en analyseer een gebied van interesse met behulp van de colokalisatiefunctie.

De overlapcoëfficiënt kan worden gebruikt om de graad van markering van het denguevirus met de Alexa Flo-kleurstof te schatten. Er werd een eenvoudige immunofluorescentie-assay uitgevoerd op virale cellen en de graad van markering kan worden geschat aan de hand van de colocalisatie van het gemarkeerde virus met anti-e-eiwit; bij kleuring met anti-antilichamen varieerden de overlapcoëfficiënten van 0,65 tot 0,8, wat suggereert dat ongeveer 65 tot 80% van de varianten waren gemarkeerd met de Alexa Flo-kleurstof. Voor een succesvolle markeringsprocedure is het belangrijk om de markeringsbuffer voor te bereiden, verse reagentia te gebruiken en de Alexa Flo-kleurstof te reconstitueren vóór de markering.

De te gebruiken kleurstofconcentratie kan verder worden geoptimaliseerd om aan uw specifieke behoeften te voldoen. Deze methode voor het horizon-labelen van het denguevirus kan potentieel worden aangepast om andere virussen te labelen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw labelingsexperiment.