Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

Het algemene doel van dit experiment is om vasculaire implantaten te beplanten met autologe, uit bloed afgeleide endotheliale progenitorcellen en vervolgens het effect van deze behandeling op trombose in een groot diermodel te observeren. Dit wordt bereikt door een perifeer bloedmonster van varkens af te nemen om late outgrowth porcine endotheliale progenitorcellen te isoleren. Vervolgens, een implanteerbaar apparaat.

De titaniumbuis in onze proof-of-principle studie is bevolkt met autologe PC's. Het apparaat wordt vervolgens geïmplanteerd in de vena cava inferior van het varken. De resultaten tonen aan dat er bescherming tegen trombose is, gebaseerd op de doorgankelijkheid van de met EPC's bevolkte titaniumbuis in tegenstelling tot de controle en de occlusie van de onbehandelde metalen buis.

Duke surgery is toegewijd aan het bevorderen van baanbrekend, innovatief onderzoek. De volgende presentatie is een voorbeeld van hoe wij over afdelingen en disciplines heen samenwerken om de geneeskunde vooruit te helpen. Dr.EK heeft een onderzoekstraject geleid om een celbevestigingstechnologie te ontwikkelen die trombose voorkomt door het bloedcontactoppervlak van vasculaire hulpmiddelen te bekleden met de eigen progenitorcellen van de patiënt.

Aangezien deze cellen zijn afgeleid van dezelfde patiënten die het implantaat zullen ontvangen, voorkomen we afstoting door het immuunsysteem. Ons succes en de hierin beschreven methoden zijn het resultaat van een grote teaminspanning. De chirurgische implantatie zal worden gedemonstreerd door Sean Gage van de afdeling vaatchirurgie, Whitney Lane, een medische student aan Duke, en mijzelf.

Ik wil nu Alexander Janssen introduceren, een PhD-student van de afdeling Biomedical Engineering, die ons in detail door het proces van het zaaien van cellen zal leiden. Ik zal demonstreren hoe titanium buizen worden gezaaid met uit bloed afgeleide endotheliale progenitorcellen vlak voor implantatie in een varkensmodel. Deze methode dient als proof of concept en dezelfde basisprincipes kunnen worden toegepast op veel andere implanteerbare hulpmiddelen, zoals nitinol stents en mechanische circulatieondersteunende apparaten. EPC's worden geïsoleerd door de mononucleaire celfractie van varkensbloed uit te platen en verschijnen gewoonlijk na ongeveer zeven dagen.

Ze kunnen worden herkend aan hun typische kasseimorfologie. Kweek de EPC's verder uit tot een totaal aantal van 9 miljoen cellen in cultuur. Spoel de geprepareerde EPC's tweemaal met serumvrij medium, waarbij u er zorg voor draagt dat de blootstelling aan licht tijdens en na de labeling wordt beperkt.

Bedek de cellen vervolgens met een fluorescent label, PKH 26 en noteer hoeveel oplossing er is toegevoegd. Incubeer de cellen gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Stop de labelingsreactie door één minuut later een gelijk volume varkensserum aan de kleurolossing toe te voegen.

Verdun de gecombineerde oplossingen één-op-één met volledig groeimedium. Aspireer vervolgens de vloeistof en spoel de cellen drie keer met volledig groeimedium, gevolgd door twee wasbeurten met DPBS zonder calcium- of magnesiumchloride. Bedek de cellen daarna met trypsine, waarbij het gebruikte volume wordt genoteerd, en incubeer ze bij 37 °C.

Na drie minuten incubatie wordt met behulp van microscopie gecontroleerd of de cellen zijn losgekomen; indien dit het geval is, wordt er twee keer zoveel trypsine-neutralisatielosure toegevoegd als er eerder is toegevoegd. Combineer de celoplossingen in één enkele buis en meet de celdichtheid met een hemocytometer. Pellet tot slot de celsuspensie en resuspendeer de cellen in ten minste 4,5 milliliters serumvrij medium.

Nadat het varken is voorbereid voor de operatie, maakt u met een scalpelmes nummer 15 een incisie in de middellijn, beginnend bij de tweede set mammae. Gebruik electrocauterisatie om voorzichtig door te snijden tot de voorlaatste set. Zet de dissectie voort tot aan de abdominale fascia.

Til het peritoneum op met mosquito-tangetjes en maak er voorzichtig een opening in met Metzenbaum-scharen, externaliseer de urineblaas en plaats een 3-0 Vicryl beursnaad in de blaaswand. Maak een kleine punctie-incisie in het centrum hiervan en voer een 16 French Foley-katheter in via de incisie. Dien vervolgens intraveneuze vloeistoffen toe om de urineproductie tijdens de operatie te titreren naar ten minste 1 ml/kg/uur.

Externalise vervolgens de kleine, vergrote darm en plaats twee bour-retractoren om het posterieure aspect van de peritoneumholte bloot te leggen en identificeer de Vena Cava Inferior (VCI) middels scherpe en botte dissectie. Maak de VCI voorzichtig vrij van het omringende weefsel. Skeletoise vervolgens het vat vanaf de rechter nierarterie proximaal van de bifurcatie van de VCI tot aan het distale uiteinde.

Wees uiterst voorzichtig tijdens de dissectie van de Vena Cava Inferior (IVC), aangezien zelfs een zeer klein defect in de IVC kan leiden tot snelle bloedingen en exsanguinatie van het dier. Ligeer alle zijtakken van het IVC-segment; besteed speciale aandacht aan het disseceren en ligeren van de twee grote posterieure lumbale venen direct proximaal van de bifurcatie van de IVC. Aan de posterieure zijde bevindt zich vaak een grote lumbale vene.

Dissekeer deze ader vrij en controleer deze met vatenlussen. Begin nu, parallel aan de operatie, met het zaaien van het implantaat met EPC's voordat deze procedure wordt gestart. De titanium buis-weefselsteunstructuren moeten volledig zijn geassembleerd en klaar voor gebruik in een steriel veld.

Open de gasgesteriliseerde titanium buisassemblage in een spuit van 5 cc. Verwijder vervolgens de zuiger uit de spuit van 5 cc, maar gooi deze niet weg. Bevestig een dop aan de spuit. Gebruik een pipet om de spuit te vullen met de EPC-suspensie.

Plaats vervolgens de zuiger terug. Verwijder de dop en steek het uiteinde van de spuit in de open siliconen slang van de opstelling totdat deze precies vastzit. Verwijder daarna eventuele luchtbellen door de celoplossing langzaam voort te duwen totdat deze de bovenkant van het hoofdstuk bereikt.

Sluit de assemblage vervolgens af met een luer-dop en plak deze dicht in een steriele handschoen. Plaats deze volledige assemblage in een bewerkte spuitenhouder en zet deze in een incubator van 37 °C. Gebruik een meetinstrument om te controleren of de zittingkamers waterpas staan en laat de assemblage incuberen met een zachte rotatie.

Zet de operatie voort direct na het afbinden van de Vena Cava Inferior (VCI) door 100 eenheden heparine per kilogram varken toe te dienen. Klem vervolgens onmiddellijk de VCI in een hoek van 45 graden distaal op de VCI en de lumbale ader, en daarna proximaal. Gebruik vervolgens een scalpelmes nr. 11 en pot-scharen om een longitudinale venotomie van vier centimeter te maken tussen de proximale en distale klemmen.

Verwijder al het bloed uit de IVC en spoel het binnenste lumen met steriele DPBS. Plaats nu het EPC-bevolkte implantaat of een bare-metal controle in de IVC om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en om lucht te verwijderen. Vul de IVC met DPBS met calciumchloride en magnesiumchloride.

Sluit vervolgens de veinotomie met een doorlopende hechting van 4-0 proline en verwijder één proximale klem om de IVC te ontluchten door middel van een kleine hoeveelheid terugbloeding. Verwijder na de bloeding de distale klem om het implantaat op zijn plaats te houden. Plaats een fixatiehechting in de PVC-slang die door de vaatwand loopt.

Sluit de fascia met OPDS op een CT-naald. Sluit de subcutane ruimte met twee o Vicryl via een doorlopende hechting. Sluit vervolgens de huid met nietjes.

Dien tot 20 milliliter 0,25% Marcaine subcutaan toe langs de incisieplaats en dek de wond af met gaas en Tegaderm tegen de pijn. Dien flu Nixon en oxymorphone subcutaan toe indien nodig. Beëindig de anesthesie en plaats het varken, zodra het ontwaakt, gedurende de volgende zeven dagen terug in zijn kooi.

Dien elke 24 uur atri toe als antibiotische profylaxe en zorg ervoor dat de fentanylpleister die vóór de operatie is aangebracht, in totaal drie dagen lang blijft plakken. Na drie dagen werden de geplaatste titanium buisimplantaten verwijderd en werden de binnenoppervlakken onderzocht. Bij een excitatiegolflengte van 550 nanometer werd in een andere buis een samenhangende laag van fluorescentie-gelabelde cellen aangetroffen.

Snedecellen werden aanvullend gekleurd met een adhesiemarker voor bloedplaatjes-endotheelcellen om de celgrenzen te visualiseren. In deze procedure kan een breed scala aan kleurstoffen worden gebruikt. In tegenstelling hiermee raakt een onbehandeld titanium buisimplant volledig verstopt in de prothrombotische omgeving met lage schuifspanning van de vena cava inferior.

Zoals geïllustreerd in afbeeldingen A en C, wordt de titanium buis waarin de cel is geplaatst getoond in afbeelding B en bleef deze vrij van stolsel na onze isolatieprocedure met varkensbloed. EPC's verschijnen na gemiddeld zeven dagen in kweek. Tijdens het uitvoeren van de chirurgische procedure is het zeer belangrijk om de IVC zorgvuldig en voorzichtig te skeletoniseren, omdat zelfs de kleinste scheur in de IVC of de zijtakken kan leiden tot uitbloeding van het varken. Na deze procedure kunnen andere bloedcontacterende materialen snel endotheeliseren om trombose te voorkomen.

Endotheliale vasculaire stents, bijvoorbeeld met onze EPC's, bootsen de natuurlijke bekleding van de bloedvatwand na en kunnen stent-restenose en trombose na de plaatsing voorkomen. Onze quick seed-technologie maakt het mogelijk om intravasculaire hulpmiddelen binnen enkele minuten in de operatiekamer of het catheterisatielaboratorium te bekleden met endotheliale progenitorcellen die uit het eigen bloed van de patiënt zijn afgeleid. Hierdoor is een langdurige ex-vivo kweek niet langer nodig.

Tijd op het apparaat zelf wordt vermeden en de technologie wordt praktisch voor vertaling naar de klinische praktijk.