High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen
3 juli 2011
Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.
Hoi, ik ben Kara Ted, ik ben Leo. Ga we. En ik ben Simon McQueen Mason.
De verteerbaarheid van plantenbiomassa is momenteel een onderwerp van grote belangstelling. Dit komt doordat er veel suikers zijn gebonden in de polysachariden van de plantencelwanden die deze biomassa vormen; als we deze suikers in een bruikbare vorm kunnen vrijmaken, kunnen we deze fermenteren om allerlei producten te produceren, zoals brandstoffen en chemicaliën. Helaas zijn deze materialen uiterst moeilijk te verteren, en het verkrijgen van een beter inzicht in wat die verteerbaarheid reguleert, is een kwestie van dringende noodzaak.
Om plantmateriaal te kunnen gebruiken voor de productie van vernieuwingsgroepen, moeten we in staat zijn om het saccharificatiepotentieel in deze planten te meten. Hier aan de Universiteit van York screenen we daarom grote populaties plantmateriaal om hun saccharificatiepotentieel te bepalen. Saccharificatie is het proces waarbij complexe koolhydraten worden afgebroken tot hun monosacharidecomponenten om waardevolle chemicaliën te produceren via verschillende industriële processen.
Om het potentieel voor saccharificatie te meten, reproduceren we industriële processen op microschaal, waarbij we biomassa onderwerpen aan een voorbehandeling en enzymatische hydrolyse om de vrijgekomen suikers te bepalen. Hiermee worden interessante variëteiten binnen genotypen geïdentificeerd. Het high-throughput systeem werkt in een IG zes-wells plaatformaat.
Er worden milde hydrolyseomstandigheden gebruikt om subtiele verschillen tussen genotypen bloot te leggen, en de methode is bovendien flexibel genoeg om verschillende substraatmaterialen te ondersteunen en verschillende enzymen te evalueren. De door ons gebruikte methode omvat het verwerken van plantmateriaal tot een poeder, dat vervolgens wordt voorbehandeld met een verdund zuur of een base bij 90 °C gedurende 20 minuten. Vervolgens wordt een enzymatische digestie uitgevoerd met een commerciële cellulase-mix bij 50 °C gedurende acht uur.
Ten slotte wordt een MBTH-methode gebruikt om de afgifte van reducerende suikers te bepalen. Het plantmateriaal wordt geoogst als droge stengels, die worden gesneden in segmenten van vier millimeter. Deze worden samen met drie metalen kogels van vijf millimeter in vials van twee milliliter geplaatst.
De vials zijn individueel gelabeld met barcodes, die worden gescand om de traceerbaarheid van de monsters te waarborgen. De monsters worden in de robots voor malen en formatteren geladen. De monsters worden automatisch gemalen en gemengd om het dispenseren van de biomassa in een 96-wells plaat mogelijk te maken.
De vials worden doorboord, waarna de vial in de robotarm wordt herpositioneerd zodat deze in een trechter staat die trilt om het poeder te doseren. De trilling van de trechter wordt geregeld door een balans om de gewenste hoeveelheid massa per well te bereiken. De biomassa wordt gedoseerd in 10 kolommen van de platen, waarbij twee kolommen worden vrijgehouden voor standaarden.
Door vier herhalingen per monster uit te voeren, laden we 20 monsters per plaat. Het hydrolysaat van deze plaat wordt in drievoud overgebracht naar PCR-platen, wat resulteert in drie optische platen. Op deze manier verkrijgen we drie bepalingen van reducerende suikers per putje biomassa.
Zodra ze zijn geformatteerd, worden de platen afgedicht met een siliconenmat om verdamping te voorkomen. Wanneer ze klaar zijn, worden ze overgebracht naar de robot voor vloeistofbehandeling. Bij de robot voor vloeistofbehandeling worden de voorbehandeling, enzymatische hydrolyse en de bepaling van de vrijgekomen suikers automatisch uitgevoerd.
De tafel van twee meter is voorzien van houders voor de verschillende benodigde reagentia, evenals opbergruimte voor het plasticware. Er zijn incubatoren aanwezig voor de voorbehandeling en hydrolyse, alsof thermocyclers voor de suikerbepaling. De voorbehandeling wordt uitgevoerd in de deep well plate.
Door verdunde zure of alkalische oplossingen toe te voegen aan het biomassapoeder. De platen worden overgebracht naar het warmteblok en geïncubeerd bij 90 °C gedurende 20 minuten. Wanneer deze incubatie is voltooid, wordt de voorbehandeling verwijderd door vijfmaal te spoelen met 500 µL acetaatbuffer.
Zodra de voorbehandeling is weggespoeld, wordt een enzymcocktail toegevoegd. Dit is een standaardmengsel. Het bevat cellulose, een novozyme 1, 8 8 in een verhouding van vier op één bij een concentratie van 7 FPU per putje.
De platen worden acht uur lang geïncubeerd bij 50 °C onder schudden. Er worden 75 µL van het resulterende hydrolysaat overgebracht naar een PCR-plaat. In kolommen 11 en 12 van de PCR-platen worden de glucosestandaarden toegevoegd.
Vervolgens worden 25 µL 1 M natriumhydroxide aan alle wells toegevoegd. Ten slotte worden 50 µL MBTH-reagens in de PCR-plaat gepipetteerd. De deep well plate wordt bewaard nadat de overdracht van het hydrolysaat naar de derde PCR-plaat is voltooid.
Terwijl de PCR-platen naar de thermocyclers worden verplaatst voor incubatie bij 60 °C gedurende 15 minuten. De laatste stap van het proces is de overdracht van het reactiemengsel naar optische platen voor de kleurontwikkeling. Na incubatie worden de PCR-platen uit de thermocycler gehaald.
Honderd µL oxiderend reagens wordt toegevoegd aan het overgebrachte reactiemengsel. Om de kleurontwikkeling te vergemakkelijken, wordt het proces voor vloeistofbehandeling vier keer in 24 uur uitgevoerd, waarbij de voorbehandelingsspoeling en de toevoeging van het enzym ongeveer twee uur duren. De enzymatische hydrolyse duurt acht uur en de suikerbepaling duurt nog eens twee uur.
Terwijl de eerste plaat acht uur lang incubeert, begint de volgende plaat aan het proces. Met deze toewijzing van robotbronnen wordt een doorvoer van 80 monsters per dag behaald om de hoeveelheid vrijgekomen reducerende suikers te bepalen. De optische platen worden uitgelezen bij 620 nanometers.
De verkregen resultaten worden geanalyseerd om de vrijgekomen suikers te kwantificeren als nanomoles per milligram per uur reactie. Bedankt voor het kijken, en ik hoop dat dit uw onderzoek naar biobrandstoffen inspireert.
Overzicht
Dit artikel presenteert een snelle methode voor het beoordelen van het versuikringspotentieel van diverse plantbiomassamonsters met behulp van een geautomatiseerd platform. Het proces omvat voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers in een high-throughput formaat.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Biomassaconversie
- Hernieuwbare Energie
Achtergrond
- Plantbiomassa bevat suikers in polysachariden die moeilijk te verteren zijn.
- Inzicht in de verteerbaarheid is cruciaal voor het benutten van plantmateriaal bij de productie van hernieuwbare brandstoffen.
- De studie richt zich op het bepalen van het saccharificatiepotentieel van verschillende plantgenotypes.
- High-throughput screening kan veelbelovende variëteiten voor industriële toepassingen identificeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om het verzacharingspotentieel van plantbiomassa te meten.
- Het faciliteren van de extractie van suikers voor fermentatie tot brandstoffen en chemicaliën.
- Het verbeteren van het begrip van factoren die de verteerbaarheid van biomassa beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Plantenbiomassa wordt voorbehandeld met zure of alkalische oplossingen.
- Enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel cellulase-mengsel.
- High-throughput screening wordt uitgevoerd in een 96-wells plaatformaat.
- Reducerende suikers worden na hydrolyse gekwantificeerd met behulp van de MBTH-methode.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een snelle beoordeling van het verzacharingspotentieel over meerdere monsters mogelijk.
- Subtiele verschillen in verteerbaarheid tussen genotypen kunnen worden gedetecteerd.
- Het geautomatiseerde proces verhoogt de doorvoer, waardoor de analyse van 80 monsters per dag mogelijk wordt.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is efficiënt voor het screenen van plantbiomassa voor industriële toepassingen.
- Het biedt inzicht in de verteerbaarheid van diverse plantmaterialen.
- Deze benadering kan helpen bij de selectie van plantvariëteiten voor de productie van biobrandstoffen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
High-throughput saccharificatie-assays maken een snelle, kwantitatieve beoordeling van de verteerbaarheid van lignocellulosische biomassa mogelijk, wat een kritiek knelpunt vormt bij de optimalisatie van grondstoffen voor bioraffinage. Dit platform ondersteunt screenings in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie door genotype-afhankelijke variabiliteit in suiker-vrijzetting bloot te leggen. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij de selectie van grondstoffen en procesontwikkeling in industriële biotechnologische pijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematisch onderzoek mogelijk naar factoren van recalcitrantie en verteerbaarheid van de plantencelwand.
- Ondersteunt de identificatie van genetische varianten of kweekvarianten met verbeterde saccharificatieprofielen.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de impact van de celwandsamenstelling op de suikervrijzetting te kwantificeren.
- Biedt datagestuurde triage voor de verdere ontwikkeling van grondstoffen in portefeuilles voor hernieuwbare chemicaliën en brandstoffen.
Screening en assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare saccharificatiemetingen over grote monsterreeksen.
- Automatiseert monsterbereiding, voorbehandeling en enzymatische hydrolyse in een 96-well formaat.
- Genereert kwantitatieve resultaten (reducerende suikers) die geschikt zijn voor vergelijkende analyse en downstream screening.
- Maakt schaalbare evaluatie van enzymformuleringen en substraattypen mogelijk voor procesoptimalisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt verteerbaarheidsgegevens op laboratoriumschaal uit met industriële procesomstandigheden voor translationele relevantie.
- Ondersteunt de continuïteit van genotypscreening tot preklinische validatie van grondstoffen in de ontwikkeling van bioraffinaderijen.
- Vermindert het risico op procesfalen in een laat stadium door vroeg in de pipeline voorspellende metrics voor verteerbaarheid te bieden.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze high-throughput assay is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar ontwikkeling van hernieuwbare grondstoffen, waarbij vroege genotypscreening wordt verbonden met preklinische procesvalidatie.
- Discovery Biology: Kwantificeert het saccharificatiepotentieel om biologische knelpunten bij de afbraak van de celwand te verduidelijken.
- Screening: Biedt reproduceerbare high-throughput assay-resultaten voor de evaluatie van genotypen en enzymen.
- Analytics: Levert data over suikerbezetting in nanomole/mg/uur voor een robuuste statistische vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt laboratoriumprofielen van verteerbaarheid met de vereisten van industriële bioraffinaderijen.
- Bedrijfmatige herbruikbaarheid: Vestigt een schaalbaar, geautomatiseerd platform dat aanpasbaar is aan diverse plantensoorten en enzymsystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van grondstoffen en het procesontwerp.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en maakt schaalbaarheid met een hoge doorvoer mogelijk.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen voor de verdere ontwikkeling van grondstoffen en enzymoptimalisatie.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van genotypen en procescondities voor industriële biotechnologische pipelines.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de biologie van plantencelwanden en analytische enzymatische hydrolyse.
- Is afhankelijk van de infrastructuur voor geautomatiseerde vloeistofbehandeling, malen en analytische instrumentatie.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding en data-analyse.
- Aanpasbaar aan diverse plantensoorten en enzymmengsels via protocolaanpassingen.
- Doorvoersnelheid en reproduceerbaarheid zijn afhankelijk van de toewijzing van robotische middelen en het onderhoud daarvan.
