Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Het algemene doel van deze procedure is om de antibioticasusceptibiliteit van bloedkweekisolaten te identificeren en te beoordelen in minder tijd dan met conventionele methoden. Dit wordt bereikt door eerst het bloedkweekisolaat te identificeren met behulp van een nieuwe 16 s ribosomaal DNA MultiPro PCR-assay.

Vervolgens wordt het isolaat zes uur lang geïncubeerd met een panel van antibiotica. De volgende stap is het bepalen van de groei of groeiremming van het isolaat in aanwezigheid van het antibioticum met behulp van een kwantitatieve 16 s ribosomaal D-N-A-P-C-R-assay. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat de identificatie en antibioticagevoeligheidstesten van een bloedkweekisolaat sneller kunnen worden verkregen via deze combinatie van kweek en PCR.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals die met geautomatiseerde Phoenix- of IIC-systemen, is dat er geen voorafgaande kweekstatus vereist is en dat de resultaten van de identificatie en antibioticagevoeligheidstesten op dezelfde dag beschikbaar kunnen zijn. De procedure wordt gedemonstreerd door Vandy Hanson en GID ing, PhD-studenten uit ons laboratorium. Verdun 100 µL bloedkweek die positief is voor microbiële groei in een reactiebuis met 900 µL 0,9% natriumchloride. Centrifugeer het monster vervolgens bij 13.400 ×g gedurende vijf minuten om de bacteriën na de centrifugatie te pelletteren.

Reese, suspendeer het pellet in 100 µL steriel gedemineraliseerd water. Bewaar het monster bij vier graden Celsius tot verder gebruik. Zodra alle monsters gereed zijn, bereid je de real-time PCR-reactiemengsels voor om specifiek 16 s ribosomaal DNA van de bacteriën van belang te amplificeren.

Gebruik gedemineraliseerd water om de volumes aan te passen naar 20 microliters per reactie. Verdeel 20 microliters PCR-mix per putje in een 96-well PCR-plaat. Voeg vervolgens vijf microliters monster toe aan elk putje en verzegel de PCR-plaat.

Voer vervolgens de PCR uit op het BI Prism 7, 900 HT real-time PCR-systeem. Om de resultaten te analyseren zodra de PCR is voltooid, gebruikt u eerst het tabblad analyse-instellingen om de CT-analyse aan te passen naar 0.1. Stel daarna de baseline-configuraties zo in dat deze beginnen bij cyclus 6 en eindigen bij cyclus 15. Noteer de CT-waarde voor elk monster.

De afkapwaarde om een PCR-resultaat als positief te beschouwen, kan over het algemeen worden vastgesteld op een CT-waarde van 35. In dit voorbeeld wordt het identificatieprofiel van een met E. coli geïnfecteerde bloedkweek getoond in twee reactiemengsels. Universele 16 s ribosomaal DNA-primers werden toegevoegd en produceerden twee amplificatiecurves met een CT van 25.2 en 25.95.

De derde amplificatiecurve is afgeleid van de probe die specifiek is voor Coli. Andere specifieke probes genereerden geen detecteerbare signalen. Zodra de pathogeen is geïdentificeerd, kan antibioticatesten worden uitgevoerd.

Begin met het overbrengen van vijf milliliter bouillon van een positieve bloedkweek naar een serumscheidingsbuis. Centrifugeer het monster 10 minuten bij 2000 ×g; gooi na de centrifugatie het scheidingsmiddel uit de buis. Breng vervolgens met een steriel wattenstaafje de bacteriën van de gellayer van de buis over naar 0,9% natriumchloride totdat een oplossing met een troebelheid van een 0,5 McFarland-standaard is verkregen.

Dit komt overeen met ongeveer 1,5 × 10⁸ colony forming units per milliliter. Verdun vervolgens de suspensie in Muller Hinton-bouillon met een dubbele concentratie om een concentratie van ongeveer 5 × 10⁵ colony forming units per milliliter te verkrijgen.

Pipetteer 50 µL van de suspensie per putje in een microtiterplaat die al 50 µL per putje van een selectie antibiotica bevat. Zorg ervoor dat er voor elk monster positieve groeicontroles worden opgenomen door putjes met water in plaats van antibiotica te gebruiken. Dek de plaat af wanneer u klaar bent.

Incubeer de plaat vervolgens zes uur bij 37 °C om bacteriële groei mogelijk te maken. Zorg ervoor dat u een aliquot van de bacteriële suspensie bewaart bij 4 °C als negatieve groeicontrole. Draag na de incubatie van zes uur de inhoud van elke well en het monster van de negatieve controle over naar afzonderlijke steriele buisjes.

Na een centrifugatie van vijf minuten bij 16.000 ×g, verwijder 80 µL supernatant en resuspendeer de pellets in 80 µL steriel gedemineraliseerd water. Verdun de monsters 1:10 in water voordat ze worden gebruikt voor 16S ribosomaal DNA real-time PCR.

Bereid de PCR-mix voor met de IQ cyber green super mix en 16 s ribosomaal DNA-primers en verdeel 20 µL per putje in een 96-well PCR-plaat. Voeg vervolgens vijf µL van elk monster toe aan de putjes en verzegel de plaat.

Voer vervolgens de PCR uit om de resultaten te analyseren. Bereken eerst de drempelwaarde voor de CT. In het algemeen is de drempelwaarde voor de CT gelijk aan de CT van de positieve groeicontrole plus 0,5 maal de CT van de negatieve groeicontrole minus de CT van de groeicontrole.

Echter, voor piperacilline met tazobactam en CEF dazadi bij gramnegatieve staafjes, evenals voor amoxicilline, oxacilline en trimetoprim met sulfamethoxazol bij Staphylococcus aureus of bij amoxicilline in Enterococcus spp., moet de vermenigvuldigingsfactor van 0,5 worden verlaagd naar 0,25. De gevoeligheid of resistentie van de stammen in elk monster kan worden bepaald door de CT van het monster te vergelijken met de cutoff ct.

Een CT-waarde boven de drempelwaarde duidt op gevoeligheid, terwijl een CT onder de drempelwaarde duidt op resistentie. Hier is een voorbeeld van een amplificatieplot voor antibiotica-gevoeligheid. De eerder geïdentificeerde e coli-stam is getest op gevoeligheid voor verschillende antibiotica, die elk worden weergegeven door een aparte curve.

Monsters met een lage CT-waarde zijn monsters waarin groei heeft plaatsgevonden in de aanwezigheid van een antibioticum, wat duidt op resistentie tegen het geteste antibioticum. Omgekeerd vertegenwoordigt een hoge CT-waarde een monster waarin geen groei heeft plaatsgevonden, wat duidt op gevoeligheid voor het geteste antibioticum. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in negen uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.