Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry
23 november 2011
Het cytochroom c oxidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) double-labeling methode maakt het mogelijk voor de directe visualisatie van mitochondriale ademhaling enzymdeficiënties in vers ingevroren weefsel secties. Dit is een eenvoudige techniek histochemische en is nuttig bij het onderzoek naar mitochondriële ziekten, veroudering, en veroudering-gerelateerde aandoeningen.
Het algemene doel van deze procedure is om directe visualisatie van tekorten in mitochondriale respiratoire enzymen in vers ingevroren weefselcoupes mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst cryostaatcoupes van het betreffende orgaan te verzamelen. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van de Cox histochemie, gevolgd door de SDH histochemie.
Ten slotte worden de weefselsneden gedehydrateerd, gemonteerd en voorzien van een dekglas. Uiteindelijk kunnen de resultaten de mate van mitochondriale dysfunctie aantonen aan de hand van de hoeveelheid cellulaire blauwe kleuring. Hallo. Vandaag gaan we het hebben over de Cox SCH dubbele labelings-HISTOCHEMISCHE techniek.
Hoewel deze methode kan worden toegepast om mitochondriële ziekten te bestuderen, kan ze ook inzicht bieden in veroudering en ouderdomsgerelateerde aandoeningen. Nadat de hersenen zijn verwijderd uit een dier dat in overeenstemming met de ethische vergunning is geofferd, moeten deze snel worden ingevroren op droogijs. Ingevroren weefsel kan, gewikkeld in aluminiumfolie, bij -80 °C worden bewaard tot het moment van sectie.
Bereid het weefsel voor op cryosectie door de hersenen op een cryostaatblok te plaatsen en deze te omringen met insluitingsmedium. Plaats het blok snel in de cryostaat en verzamel coupes van 14 micron bij minus 21 graden Celsius. Ontdooi de coupes op objectglazen met behulp van een warmteblok en laat de objectglazen vervolgens één uur drogen bij kamertemperatuur.
Plaats de coupes in een kleurkamer voor coupes met natte papierstrips. Omdat reactietijden essentieel zijn bij deze assay, wordt aanbevolen om maximaal 10 coupes per experiment onder een zuurkast te verwerken. Bereid het incubatiemedium voor, bestaande uit dab en cytochroom C in PBS, en meng dit met een vortex.
Voeg snel twee microgram boviene CDE's toe aan het medium en meng goed door te vortexen. Om alle korrels CDE's op te lossen terwijl u nog steeds onder de zuinetkast werkt, brengt u 150 tot 200 microliter incubatiemedium aan op elke slide, waarbij u de pipetpunt gebruikt om het gelijkmatig over alle secties te verspreiden. Incubeer de slides gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius.
Verwijder na 40 minuten het incubatiemedium van de objectglazen. Was de objectglazen vier keer in PBS, telkens gedurende 10 minuten. Plaats de objectglazen na het wassen, terwijl u onder een zuurkast werkt, terug in de kleurkamer voor objectglazen met natte papierstrips.
Bereid de NBT-oplossing in PBS voor, waarbij u er zorg voor draagt dat het PMS tegen licht wordt afgeschermd. Vortex de oplossing kort en breng 150 tot 200 µL van de NBT-oplossing aan op elke slide, waarbij u de pipetpunt gebruikt om de vloeistof gelijkmatig over alle secties te verspreiden. Incubeer de slides 40 minuten bij 37 °C. Verwijder na 40 minuten de overtollige oplossing van de slides. Was de slides vier keer in PBS, telkens gedurende 10 minuten.
Dehydrateer de coupes gedurende twee minuten per stap in de volgende opeenvolgende concentraties ethanol: 70%, 70%, 95%, 95% en 99,5%. Laat de coupes vervolgens nog 10 minuten rusten in een extra stap met 99,5%. Plaats de coupes gedurende 10 minuten in xyleen, monteer met LAN en breng dekglas aan.
Laat de coupes hier een nacht of ten minste één tot twee uur drogen in een geventileerde ruimte. Brenducties van wild-type en vervroegd verouderende MT.DNA Mutator-muizen werden sequentieel gelabeld voor COX- en SDH-activiteiten.
Normale Cox-activiteit, aangegeven door de donkerbruine kleuring, is zichtbaar in de hippocampus van wild-type muizen. Cox-deficiënties, aangegeven door de blauwe kleuring, werden aangetoond in de hippocampus van MT DNA mutator-muizen op 12 en 46 weken. Er was een verdere afname van de Cox-activiteit bij een leeftijd van 46 weken bij M-T-D-N-A mutator-muizen, wat wijst op een wijdverspreide verergering van de dysfunctie van de ademhalingsketen.
Onvoldoende incubatietijden van 10 en 25 minuten resulteerden in een verminderde depositie van het bruine DAB-reactieproduct. De verkorte incubatietijden maakten de vorming van het blauwe Foran-eindproduct mogelijk tijdens de SDH-incubatie, wat misleidend wees op de aanwezigheid van cellen met COX-deficiënties. Het dekglas tijdens de COX-incubatie leidde eveneens tot een onjuiste vorming en depositie van het DAB-reactieproduct.
Hoewel Cox- en SDH-activiteiten afzonderlijk kunnen worden gelabeld zoals hier wordt getoond, is gebleken dat sequentieel labelen voordelig is bij het lokaliseren van cellen met mitochondriële dysfunctie. Een voorbeeld van een specificiteitscontrole voor COX- en SDH-activiteiten in hersenen van een wild-type muis laat een negatieve labeling zien. Vergeet daarom niet dat het werken met de chemicaliën bij de Cox SCH dubbele labeling volgens het chemische protocol extreem gevaarlijk is; voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van passende laboratoriumkleding en een masker, het werken onder de zuurkast en het correct afvoeren van het incubatiemedium moeten telkens worden nageleefd wanneer u deze assay uitvoert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De dubbele kleuringsmethode voor cytochroom c oxidase/natriumdehydrogenase (COX/SDH) maakt de visualisatie van tekorten aan mitochondriale respiratoire enzymen in vers bevroren weefselsneden mogelijk. Deze histochemische techniek is bijzonder nuttig voor het onderzoek naar mitochondriale ziekten en ouderdomsgerelateerde aandoeningen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Mitochondriaal onderzoek
Achtergrond
- Mitochondriële dysfunctie is gekoppeld aan diverse ziekten.
- Inzicht in enzymdeficiënties kan helpen bij het diagnosticeren van mitochondriële aandoeningen.
- Histochemische technieken maken directe visualisatie van enzymactiviteit mogelijk.
- Vers-bevroren weefselcoupes behouden de cellulaire architectuur.
Doel van de studie
- Om deficiënties van mitochondriale respiratoire enzymen te visualiseren.
- Om de rol van mitochondriale dysfunctie bij ziekten te onderzoeken.
- Om een eenvoudige methode voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van cryostaatsneden van het betreffende orgaan.
- Uitvoeren van COX-histochemie.
- Uitvoeren van SDH-histochemie.
- Dehydratatie, monteren en afdekken van de weefselsneden.
Belangrijkste resultaten
- De resultaten geven de mate van mitochondriale dysfunctie aan.
- De blauwe cellulaire kleuring correleert met de enzymactiviteit.
- De methode maakt een duidelijke visualisatie van enzymdeficiënties mogelijk.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van veroudering en aanverwante aandoeningen.
Conclusies
- De COX/SDH-dubbelkleuringsmethode is effectief voor het bestuderen van mitochondriële dysfunctie.
- Deze techniek kan ondersteuning bieden bij de diagnose van mitochondriële ziekten.
- Het biedt waardevolle inzichten in mitochondriële veranderingen die verband houden met veroudering.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De beoordeling van de mitochondriale respiratoire functie is cruciaal voor targetvalidatie in programma's voor neurodegeneratieve en ouderdomsgerelateerde ziekten. De histochemische methode met COX/SDH-dubbele kleuring maakt directe visualisatie van enzymdeficiënties mogelijk, wat bijdraagt aan het mechanistische de-risking van mitochondriale targets. Deze aanpak biedt voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door de integriteit van mtDNA te koppelen aan functionele bioenergetische read-outs.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door mtDNA-gecodeerde COX-activiteit te koppelen aan de functie van de ademhalingsketen.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk via directe histochemische uitlezing van enzymactiviteit in weefselcoupes.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door verbindingen te identificeren die COX-deficiënte fenotypen in ziektemodellen herstellen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het vaststellen van de basislijn van de mitochondriële functie.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste enzymactiviteitsgegevens via de lokalisatie van DAB- en NBT-producten.
- Hergebruik van platform: Maakt schaalbare beoordeling van de mitochondriële gezondheid over meerdere organsystemen mogelijk met behulp van gestandaardiseerde histochemische workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door mitochondriale dysfunctie te modelleren zoals waargenomen in verouderings- en mtDNA-mutator-modellen.
- Operationele waarde: Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via consistente read-outs van enzymactiviteit.
- Risicobeperking: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door dysfunctie van de ademhalingsketen in de loop van de tijd te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses via lead-identificatie tot preklinische validatie, door functionele mitochondriale read-outs te bieden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de visualisatie van COX- en SDH-activiteit in gedefinieerde hersengebieden.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde incubatie-, was- en dehydratatiestappen, wat reproduceerbare kleuring waarborgt.
- Analytica: Maakt vergelijkende conditieanalyse mogelijk via kwantitatieve blauwe en bruine kleuring die correleert met SDH- en COX-activiteit.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door het modelleren van leeftijdsafhankelijke verergering van respiratoire kettingdysfunctie in mutator-muizen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar histochemisch platform voor mitochondriale beoordeling over verschillende therapeutische gebieden.
Operationele en bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in modellen voor mitochondriële ziekten.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de visualisatie van enzymactiviteit in coupes.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen mitochondriële programma's.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van functioneel herstel van COX-deficiënte cellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in histochemie en mitochondriale biologie voor een nauwkeurige uitvoering en interpretatie van de assay.
- Is afhankelijk van een cryostaat, incubatiekamers en zuurkasten voor de preparatie van coupes en het hanteren van reagentia.
- Vereist cross-team standaardisatie van incubatietijden, reagentiaconcentraties en wasprotocollen om artefacten te vermijden.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de methode op niet-neurale weefsels zoals het hart of de lever.
- Bevat praktische beperkingen zoals het hanteren van gevaarlijke reagentia (DAB, NBT, PMS) en de noodzaak van bewaring van vers ingevroren weefsel.
