Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van biomarkers in volledige weefselcoupes van menselijke kanker nauwkeurig te kwantificeren, om zo een numerieke waarde toe te kennen aan de graad van heterogeniteit in de eiwitexpressie. Dit wordt bereikt door eerst immunofluorescentie-gelabelde coupes van kankerweefsel te scannen met een fluorescente whole-slide scanner. Vervolgens worden regio's van belang binnen de tumor geselecteerd voor evaluatie.

Vervolgens wordt de expressie van het eiwit van belang binnen de invasieve tumorgebieden gekwantificeerd met behulp van het aqua analysis geautomatiseerde beeldanalysesysteem. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om de expressie van biomarkers in kankersweefsel in kaart te brengen, dat vaak zeer heterogeen is over de weefselcoupe. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze technieken ten opzichte van traditionele methoden, zoals immunohistochemie met kleur- en metrische visualisatiereagentia, is dat immunofluorescentie kwantitatiever en gevoeliger is.

Door deze analytische methoden te koppelen aan een volledige sectie, immunofluorescentie-scanning, is het mogelijk om subtiele variaties in biomarker-expressie over weefsels heen gedetailleerd in kaart te brengen. Voor het eerst worden deze procedures gedemonstreerd door Mark Gustafson, operationeel directeur bij het Histo RX-laboratorium. Nadat een biopsie van kankerveefsel met een microtoom is gesneden en het specimen via immunofluorescentie is gekleurd voor de expressie van de biomarkers van belang, worden maximaal vijf objectglazen van de gekleurde secties in de cassette van de slide-scanner geplaatst.

Gebruik vervolgens de interface in de ScanScope-console. Selecteer voor elke slide een gebied dat al het weefsel op de slide omvat, ongeacht het kleuringspatroon of andere waarneembare aspecten van het monster. Selecteer daarna via de ScanScope-console eerst een weefselgebied om te evalueren, bij voorkeur binnen het tumorgebied van het weefsel om de meest representatieve weergave te verkrijgen.

Bepaal nu met de functie voor automatische belichting van de scan scope-console de belichtingstijd voor elk kanaal samen met de beeldfocus; gebruik de blauwe ruit op het beeld van de scan scope-console om een extra gebied te selecteren dat zich buiten het weefsel bevindt, maar nog steeds binnen het gebied van de slide onder het dekglas, om het achtergrondgebied te definiëren waar de beelden voor de flat-field correctie worden verkregen. Voeg voor elk filter focuspunten toe aan het weefselgebied, weergegeven door gele vierkantjes, om de beeldopname te optimaliseren. Als de beelden een hoge achtergrond of andere beeldartefacten vertonen, moet het beeldgebied worden verplaatst en moeten er nieuwe beelden worden verkregen.

Het weefsel wordt vervolgens gescand en de verkregen digitale slide-afbeeldingen worden automatisch geüpload naar de Aperio Spectrum-database. Dubbelklik op de miniatuurafbeelding in het Spectrum-programma om de slide voor analyse te selecteren uit de lijst met digitale slides in de Spectrum-database. Gebruik vervolgens de bijbehorende geannoteerde H&E-afbeelding om het interessegebied op de fluorescentieafbeelding te annoteren.

Meerdere regio's van interesse die met individuele cirkels zijn afgebakend, kunnen op een enkel monster worden geselecteerd. De geannoteerde afbeeldingen worden automatisch opgeslagen in de spectrumdatabase. Selecteer nu Analyse in de menubalk bovenaan het scherm; wanneer het analysevenster verschijnt, selecteert u histo RX aqua analysis in het uitklapmenu.

Wanneer u klaar bent om te beginnen, drukt u op de analyseknop. Er verschijnt een geminimaliseerd consolevenster in de Windows-taakbalk waarin de voortgang van de overdracht van de afbeeldingen van de Spectrum-database naar de lokale computer wordt weergegeven. Zodra de gegevens zijn overgedragen, wordt aqua analysis gestart om een aqua-score te genereren met behulp van een unsupervised aqua-scoringsalgoritme, gebaseerd op de dataclustering van een eerste drempelwaarde van het monster: het pan-cytokeratine-afbeeldingssignaal boven het achtergrondafbeeldingssignaal. Dit maakt het mogelijk om de pixels te gebruiken voor het definiëren van een tumormasker, dat vervolgens kan worden gebruikt voor daaropvolgende berekeningen.

Gebruik de pixels met een hoge expressie van pan-cytokeratine om ook de cytoplasmatische of niet-nucleaire regio's van de tumorcellen te definiëren. Zoals hier te zien is, worden de pixels met een sterk signaal in het DPI-kanaal die zich binnen het tumormasker bevinden, als nucleair geïdentificeerd. Indien bij beoordeling velden worden geïdentificeerd die niet geschikt zijn voor scoring vanwege monster- of beeldeffecten, worden deze velden uitgesloten van de scoring en resulteren zij tevens in een definitief resultaat van 'fail'.

De resultaten van de aqua scoring worden weergegeven als een tabel met scores die gekoppeld zijn aan elke tegel van 512 bij 512 pixels in het interessegebied binnen een volledig weefselcoupe-monster, welke opgeslagen kunnen worden en gebruikt kunnen worden voor daaropvolgende statistische analyse. Deze met hematoxyline en eosine gekleurde fotomicrografieën tonen aan hoe verschillende gebieden van dezelfde eierstokkanker een variabele morfologie kunnen vertonen. Het sterk vergrote beeld rechtsboven in Figuur B benadrukt cellen met cytoplasmatische opheldering en een solide groeipatroon in het bovenste gedeelte van de tumor.

Het onderste deel van het weefsel dat is vergroot in het gedeelte rechtsonder van Figuur C vertoont echter een homogener eosinofiel cytoplasma en een papillair groeipatroon. Hier worden in de bovenste en onderste panelen respectievelijk heterogeniteits-heatmaps van de ER-expressie in een weefselcoupe van eierstokkanker vóór en na een chemotherapiebehandeling getoond. Let op de overgang van een variabele ER-expressie over de coupe, met regio's van zowel hoge als lage expressie in de bovenste figuur, naar een gelijkmatige verdeling van hoge ER-expressie, in rood weergegeven in de onderste figuur.

De numerieke weergave van deze verandering wordt links aangeduid door de afname van de Simpsons-index. In deze figuur worden heterogeniteits-heatmaps van HER2 in een weefselcoupe van eierstokkanker opnieuw getoond voor en na therapie, respectievelijk te zien in de bovenste en onderste panelen. Let opnieuw op de verandering van een variabele HER2-expressie over de coupe, met regio's van zowel hoge als lage expressie in de bovenste figuur, naar een gelijkmatige verdeling van hoge HER2-expressie in de onderste figuur.

Opnieuw is te zien dat de Simpsons-index afneemt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de data die door de computationele analyse wordt gegenereerd, afhankelijk is van de kwaliteit van de kleuring, en deze moet voldoen aan een hoge technische standaard.