Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

Het algemene doel van dit video-artikel is om een techniek te beschrijven om adherente cellen bloot te stellen aan laminaire stromingscondities en de respons op goed kwantificeerbare vloeistofschuifspanningen te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst het stromingscircuit te assembleren zonder de stroomkamer. Het circuit omvat het reservoir, de pulsdemper, harde buizen, zachte buizen, vierwegkraantjes en aangesloten Luer-adapters, evenals een luchtfilter.

De volgende stap is het vullen van het circuit met de gewenste perfusievloeistof, zoals celmedium onder steriele omstandigheden, waarna de pomp wordt gestart om de pulsdemper te vullen en de lucht uit de slang te verwijderen. Vervolgens wordt de slide met cellen in de bodemplaat van de flowkamer geplaatst. De laatste stap van de procedure is de volledige assemblage van het flowcircuit met de flowkamer in lijn.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de uitlijning van fluorescentielabelled endotheliale progenitorcellen onder blootstelling aan vloeistofschuifspanning in de transparante kamer tonen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Om het functionele gedrag van cellen te bestuderen, is het vaak noodzakelijk om de in vivo fysiologie na te bootsen door de cellen bloot te stellen aan vloeistofschuifspanning. Wij hebben een parallelle plaatstroomkamer en een circuit voor continue stroming ontworpen, waarmee we de cellen onder stroomcondities kunnen bestuderen en via de transparante kamer kunnen observeren.

Deze techniek kan dienen als een waardevol onderzoeksinstrument voor de gebieden van de geneeskunde en techniek. Onze flowkamer maakt intermitterende of real-time visualisatie van cellen onder stroming mogelijk met behulp van een rechtopstaande of omgekeerde microscoop. Bovendien stelt het ontwerp van Dr. Ach Nick onderzoekers in staat om cellen op zowel transparante als radiopake oppervlakken te beelden met behulp van standaard microscooplenzen.

Bovendien kan het dienen als een belangrijk instrument in farmacologisch onderzoek om het effect van geneesmiddelen op cellen onder stroomcondities te bestuderen. Visualisatie van de opstelling is cruciaal, omdat verschillende stappen moeilijk te beheersen zijn door enkel een protocol te lezen. Ik zal stap-voor-stap instructies geven over hoe de stroomkamer en het stroomcircuit, die gebruikelijk zijn in het laboratorium van Dr.Ock Next, moeten worden opgezet om het stroomcircuit te assembleren.

Begin met het bevestigen van een segment harde slang van 36 inch aan het ene uiteinde van een pulsdemper en aan het andere uiteinde. Bevestig een segment zachte slang van 18 inch. Plaats een male lure-adapter van een achtste inch aan het uiteinde van het 18 inch lange gedeelte zachte slang.

Verbind de mannelijke koppeling met een vrouwelijke adapterkoppeling van een achtste inch. Bevestig de vrouwelijke koppeling aan een nieuw segment zachte slang van 18 inch. Boor drie gaten in een dop van een glazen bekerglas van 250 milliliter.

Om de slang te passen, plaatst u een segment van 1,5 inch zachte slang in één gat als ontluchting. Steek de vrije uiteinden van de harde en zachte slang via de andere twee gaten in de dop in de glazen fles van 250 milliliter, die als reservoir dient.

Zorg ervoor dat de harde buis de bodem van het reservoir bereikt. Het handhaven van steriliteit tijdens de installatie van het circuit is cruciaal voor het succes van deze procedure. Daarom moeten alle onderdelen gesteriliseerd zijn en moet u gedurende het hele proces steriele handschoenen dragen.

Naast de geassembleerde onderdelen moeten deze onderdelen worden gesteriliseerd. Eén volledige flowkamer, segmenten zachte slang van drie bij twee inch, één mannelijke en één vrouwelijke luer-adapter van een achtste inch, vier platkopsschroeven van een halve inch, 6 5 16 inch, acht platkopsschroeven van 30 seconds inch tracks per inch, één pincet, één glazen objectglas en twee handdoeken, gesteriliseerd met stoom.

Autoclaveren bij 121 °C gedurende 60 minuten. Plaats de flowkamer van het flowcircuit, vier vierweg-stopkranen, één eenweg-stopkraan en alle gesteriliseerde onderdelen op dit steriele veld. Sluit, terwijl u steriele handschoenen draagt, de twee vierweg-stopkranen aan elkaar.

Plaats doppen op de open monsterpoorten. Verwijder de mannelijke en vrouwelijke lure-adapters die de twee zachte slangsegmenten van het stroomcircuit verbinden en plaats de aangesloten stopkranen. Bevestig de zachte slang die in het reservoir is ingevoerd aan een spuit van 30 milliliter en verwijder de zuiger van de spuit.

Vul het flesje met 125 milliliters EPC-medium. Sluit de zachte slang opnieuw aan op de stopkraan. Plaats een steriel spuitfilter in de ontluchting.

Plaats nu het stroomcircuit in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Klem de harde slang in de masterflex-rolpompkop die is aangegeven voor gebruik met dit type coal Palmer-slang. Zorg ervoor dat de slang niet overlapt met de montagegeleiders van de rolpomp.

Markeer de slang aan weerszijden waar deze de pompkop verlaat met een markeerstift. Nadat is vastgesteld dat alle stopkranen naar de monsterpoorten toe gesloten zijn en langs het stroomcircuit openstaan, start u de pomp. Controleer de stroomrichting.

De PERFUSE eight moet vanuit het glazen reservoir via de harde slang naar de pulsdemper bewegen. Gebruik voor de montage van de stroomkamer steriele handschoenen om een zacht slangsegment van twee inch te verbinden met een vrouwelijke luer-adapter van een achtste inch. Verbind een ander zacht slangsegment van twee inch met een mannelijke luer-adapter van een achtste inch.

Bevestig de twee inch zachte slang met vrouwelijke luer-adapter aan de instroompoort en de twee inch zachte slang met mannelijke luer-adapter aan de uitstroompoort. Bevestig vierweg-stopkraantjes aan beide luer-adapters. Verbind het resterende stuk twee inch zachte slang met de zijpoortconnector van de belvanger en bevestig een eenweg-stopkraantje met steriele pincetten.

Verwijder de met cellen gezaaide slide uit het kweekvat en plaats deze in de uitsparing van de bodemplaat van de flowkamer. Zorg ervoor dat de slide wordt geplaatst met de zijde met cellen naar boven gericht. Gebruik een spuit of pipet om 10 milliliters warm EPC-medium over de gezaaide slide te plaatsen. Laat het medium de slide in de flowkamer bedekken, maar zorg dat het medium niet over de O-ring op de bodemplaat stroomt.

Plaats de bovenplaat van de stroomkamer op de onderplaat, waarbij de schroefgaten worden uitgelijnd. Houd de twee platen parallel om te voorkomen dat er luchtbellen in de kamer komen. Schroef de platen samen. Ontlucht de bellenvanger van de instroom door de eenrichtingsstopkraan te openen die is verbonden met de poort van de bellenvanger aan de instroomzijde, met behulp van een automatische batterijgevoede schroevendraaier.

Gebruik een spuit van 10 milliliter om de toevoerleiding voorzichtig door te spoelen met EPC-medium en sluit vervolgens deze stopkraan en zet er een dop op. Ontlucht nu het kanaal van de kamer door de vierwegstopkraan van de uitlaatpoort te openen en voorzichtig EPC-medium door de stroomkamer te spoelen. Gebruik opnieuw een spuit van 10 milliliter om alle aansluitingen van de vierwegstopkranen af te doppen en af te sluiten.

Plaats de stroomkamer samen met het geassembleerde stroomcircuit in de bevochtigde incubator. Pauzeer de pomp van het stroomcircuit en sluit de stopkranen in de stroomrichting af om lekkage te voorkomen.

Sluit de stroomkamer aan op het stroomcircuit. Nadat de stroomkamer aan het stroomcircuit is gekoppeld, opent u de stopkranen in de stroomrichting. Start de stroompomp opnieuw en controleer of de PERFUSE eight in de juiste richting stroomt. Stel de stroomsnelheid in op de gewenste schuifspanning.

Tijdens het stroomexperiment kan de stroomkamer uit het circuit worden verwijderd om de cellen via licht- of fluorescentiemicroscopie te visualiseren. Koppel hiervoor de stroomkamer los van het stroomcircuit bij de stopkraan-stopkraanverbindingen. Neem perfusie-monsters af voor analyse.

Pauzeer eerst de pomp en sluit de stopkraan die zich het dichtst bij de pulsdemper bevindt. Verwijder de beschermkap en plaats deze ondersteboven om contaminatie te voorkomen. Voer een kleine spuit in de monsterpoort in.

Sluit de stopkraan af in de richting van de stroomkamer, terwijl de monsterpoort en het circuit in de richting van de pulsdemper open blijven. Trek de gewenste hoeveelheid monster uit het circuit en sluit de stopkraan naar de monsterpoort af voordat u de spuit verwijdert. Bewaar het monster in een gelabeld flacon en vries dit in bij minus 80 °C.

Sluit de monsterpoort af en zorg ervoor dat alle stopkranen openstaan voordat de stroming wordt gestart. Met deze methode kunnen uit menselijk bloed afgeleide endotheliale progenitorcellen binnen 15 minuten op titanium glaasjes worden gezaaid en hechten zij onder fysiologische schuifkrachten. Zoals in deze figuur te zien is, spreiden EPC's zich onder invloed van de stroming uit van ongeveer 210 vierkante micron direct na het zaaien naar ongeveer 657 vierkante micron na drie uur en ongeveer 1.152 vierkante micron na 48 uur van vloeistofschuifspanning van 15 dines per vierkante centimeter.

Deze lichtmicroscoopafbeelding illustreert de willekeurige oriëntatie van menselijke EPC's. Na een statische rustperiode van zes uur na drie uur stroming bij 100 dines per vierkante centimeter, zijn de cellen uitgespreid maar behouden ze een willekeurige oriëntatie. Na 48 uur vloeistofschuifspanning bij 100 dines per vierkante centimeter zijn de EPC's uitgelijnd en georiënteerd in de richting van de stroming.

Hier werden EPC's gelabeld met CTO en celkernen gekleurd met herx om na de flow te sterven. Ter vergelijking toont deze afbeelding porcine EPC's op titanium glaasjes, uitgelijnd met de stroomrichting. Na 48 uur flow en blootstelling aan een schuifspanning van 15 dines per vierkante centimeter werden de celranden gekleurd met anti-pcam-kleuring en de kernen met cytoxine-nucleïnezuurkleuring.

Deze methode maakt het daarnaast mogelijk om op vooraf vastgestelde tijdstippen monsters van de PERFUSE eight te verkrijgen voor de analyse en/of kwantificering van uitgescheiden celmetabolieten. Hier wordt een voorbeeld getoond van de productie van nitriet tijdens een flow-experiment van 48 uur met porcine EPC's. Het is bij het uitvoeren van deze procedure belangrijk om gedurende het gehele proces de steriliteit te bewaken.

Daarnaast is het belangrijk om de nodige stappen te ondernemen om het aantal luchtbellen in de flowkamer te verminderen vóór de start van de continue flow, aangezien deze de cellen kunnen losscheuren. We raden ook aan om elke afzonderlijke verbinding in de flowkamer en het circuit vóór perfusie te controleren om lekkage van PERFUSE eight tijdens een experiment te voorkomen. Deze kamer is ontworpen met ingebouwde O-ringen die een volledige aansluiting van de boven- en onderplaat mogelijk maken en een lekvrije afdichting bieden zonder dat vacuümpompen vereist zijn.

Deze functie garandeert bovendien een constante kamerhoogte tussen experimenten en maakt rubberen pakkingen of aanpassingen overbodig. Onze flowkamer maakt gebruik van gestandaardiseerde microscopische objectglazen. Hierdoor is een groot aantal cellen beschikbaar voor verdere experimenten.

Bijvoorbeeld, RNA en DNA uit cellen na stroming kunnen worden geëvalueerd op eiwitsynthese of genexpressie. Ons circuitontwerp maakt het mogelijk om acht geperfuseerde monsters te verzamelen voor analyse en kwantificering van celmetabolieten zoals nitriet, een primaire oxidatieve metaboliet van stikstofmonoxide, die door cellen wordt uitgescheiden onder vloeistofschuifspanning. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u onze stroomkamer en het steriele stroomcircuit assembleert om adherente cellen bloot te stellen aan vloeistofschuifspanning.