Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster

Het algemene doel van deze procedure is om de genregulerende activiteiten van CIS-regulatoire elementen of CRE's die actief zijn tijdens de metamorfose-ontwikkeling van drosophila melan gastro kwantitatief te meten. Begin met site-specifieke integratiemethoden om lijnen van CRE's te genereren die als reporter-transgenen transgeen zijn ingebouwd. Verkrijg met behulp van een stereomicroscoop transgene exemplaren in het juiste ontwikkelingsstadium.

Verwijder de specimens uit de buitenste pub en monteer ze op een glazen microscoopglas. Registreer vervolgens het niveau en het patroon van de expressie van het fluorescerende reportereiwit in whole-mount monsters middels confocale microscopische analyse. Kwantificeer tot slot het niveau van de expressie van het fluorescerende reportereiwit voor de opgenomen confocale beelden met behulp van de Image J-softwaretool.

Deze resultaten wijzen een niveau van genregulerende activiteit toe om regulatoire elementen te identificeren en verdere vergelijkende genexpressiestudies op gemodificeerde CRE-versies te faciliteren. Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in genregulatie en de wijze waarop deze genregulatie is gecodeerd. DNA is essentieel voor de ontwikkelings- en evolutiebiologie.

Deze procedure is ontwikkeld om inzicht te verschaffen in cis-regulatoire elementen die functioneren tijdens de metamorfose van drosophila melanogaster. In principe kan deze methode echter worden toegepast op cis-regulatoire elementen die functioneren tijdens andere ontwikkelingsstadia en bij andere fruitvliegensoorten, of zelfs bij andere modelorganismen. Om transgene lijnen uit te breiden, worden er op om en om opeenvolgende dagen twee vials klaargezet met meerdere mannelijke en vrouwelijke vliegen.

Breng de vliegen van een van de vials over naar een nieuwe vial. Herhaal dit gedurende een week. Verifieer na twee weken dat de transgene fruitvliegen zich in diverse ontwikkelingsstadia bevinden, van larve tot volwassene.

Begin met de stadiering van de specimens aan het einde van het derde larvale instarstadium wanneer de ER is gevormd. Let op dat het specimen niet mobiel is. De ER is zacht wit en de sferulen zijn afgewend; specificeer dit tijdstip.

Op 0 HAPF. Onderscheid mannetjes van vrouwtjes door de aanwezigheid van bilateraal gelegen gonaden nabij het midden van het lichaam, die zichtbaar zijn als doorschijnende cirkels voor het bepalen van het stadium op basis van de lengte van de metamorfose. Breng de exemplaren op 0 HAPF over naar een nieuw flacon met behulp van een bevochtigd penseel.

Voeg een stukje Kim wipe toe en maak dit vochtig met water om te voorkomen dat de specimens uitdrogen. Incubeer het flacon vervolgens bij 25 °C tot het gewenste HAPF is bereikt. Alternatief kunnen de specimens in stadia worden ingedeeld door te sorteren op basis van de identificatie van de aanwezigheid en positie van verschillende morfologische markers, zoals gedetailleerd in de bijbehorende tekst.

Plak met laboratoriumtape een stuk verpakkingstape op een dissectieplaat, waarbij de kleefzijde naar boven is gericht. Maak een verfkwast nat en bevochtig de gefixeerde specimens met de kwast. Breng de specimens over naar een Kimwipe.

Breng de specimens over naar de verpakkingstape en plak ze vast met de dorsale zijde naar boven. Laat de specimens 15 minuten drogen. Open de ER geleidelijk met een pincet.

Begin bij het anterieure of permeate uiteinde en werk in de richting van het posterieure uiteinde. Breng de pui vervolgens over naar een druppel viskeuze olie op een microscoopglaasje en evalueer het preparaat microscopisch voor hele mounts. Gebruik het 4x of 10x objectief om het preparaat in focus te brengen.

Pas met de software van de confocale microscoop de excitatiegolflengte voor het gewenste fluorescerende eiwit aan om fotobleking te voorkomen. Begin met een laserintensiteit van 5 tot 10%. Als het signaal onvoldoende is, verhoog dan de intensiteit naar behoefte om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Schakel voor confocale beelden software-instellingen in die pixelmetingen van herhaalde scans middelen, zoals kalman-middeling, voor kwantitatieve vergelijkingen van de CRE-activiteit in de C-sectie waar de fluorescentie het meest intens is.

Schakel over naar een lookup-tabel voor verzadigingswaarschuwingen en pas de kanaalspanningsversterking en offset aan naar instellingen waarbij weinig pixels verzadigd zijn. Pas indien nodig de confocale apertuur aan. Zodra de optimale instellingen zijn bepaald, voert u de ZS-scan uit om een reeks beelden langs de Z-as te verkrijgen.

Zodra de scan is voltooid, wordt de beeldstapel omgezet in een projectie en wordt dit beeldbestand in TIF-formaat opgeslagen. Gebruik voor een kwantitatieve vergelijking van de CRE-activiteiten dezelfde confocale instellingen voor alle replica-monsters en reporter-transgenlijnen. Open voor het experiment met het Image J-programma een TIFF-afbeelding die geëvalueerd moet worden.

Klik op de knop voor vrije selectie en omtrek het gebied van het specimen waar quantificatie gewenst is. Om een statistiek van de pixelwaarde te verkrijgen, klikt u op het tabblad analyse en selecteert u vervolgens meten. Noteer de gemiddelde pixelwaardescore uit het resultatenvenster.

Verzamel daarnaast een tweede gemiddelde pixelwaarde uit een achtergrondregio waar het CRE niet actief is. Om een gecorrigeerde gemiddelde pixelwaarde af te leiden, gaat u verder met het genereren van pixelwaardestatistieken voor replica-monsters. Bepaal vervolgens op basis van de gecorrigeerde gemiddelde pixelwaarden van de replica's de gemiddelde regulatoire activiteit voor een CRE en bereken ook de standaardfout van het gemiddelde.

Dit experiment maakt gebruik van de intensiteit van het white rescue oogfenotype om transgene lijnen homozygoot te maken. Een genetische achtergrond van een white-genmutant met een A TTP landing site-sequentie wordt gebruikt voor site-specifieke integratie van het transgen. Transgene individuen, hemizygoot en homozygoot voor de geïntegreerde vector, worden onderscheiden op basis van de intensiteit van het geredde oogkleurfenotype, bepaald door het aantal kopieën van het geïntegreerde mini white-gen.

Homozygote lijnen worden vervolgens tot stand gebracht door mannelijke en vrouwelijke vliegen met het fenotype van de donkerste oogkleur te kruisen. Morfologische markers worden gebruikt om het metamorfosestadium van drosophila te bepalen tijdens de metamorfose van larve naar een volwassen fruitvlieg. Het exemplaar doorloopt een reeks stereotype morfologieën die kunnen worden gebruikt om het geslacht te bepalen en het ontwikkelingsstadium te benaderen. Hier.

Een wild-type versie van een CRE, aangeduid als het dimorfe element, stuurt hoge niveaus van EGFP-reporterexpressie aan in het ASIC-abdominaalsegment van vrouwelijke puy. Een sequentie van 13 basenparen binnen dit CRE bleek een bindingsplaats te zijn voor de DSX-transcriptiefactor en het in vivo belang van deze sequentie wordt aangetoond door de regulatoire activiteit van het CRE te kwantificeren wanneer deze bindingsplaats gemuteerd is. Kwantitatieve analyses geven aan dat de mutatie van deze DSX-plaats de regulatoire activiteit reduceerde tot 28 plus of minus 3% van de wild-type expressie in de context van de hier gebruikte transgeen-insertieplaats.

Vergelijkbare analyses evalueren de regulatoire activiteiten voor intraspecifieke CRE-allelen of tussen autologe CRE's van verschillende soorten, bijvoorbeeld vergeleken met de EGFP-niveaus in het vrouwelijke segment. Autologe CRE's voor de soorten D. stimulants en D. willi, aangestuurd door de D. Melin gastric Canin S-stam, bezitten regulatoire activiteiten van respectievelijk 75 ± 4% en 0 ± 0%. Vervolgprocedures zoals RNA-interferentie kunnen worden toegepast op transcriptiefactorgenen om aanvullende vragen te beantwoorden over de interactie tussen deze transcriptiefactorgenen en CYS-regulatoire elementen.

Dit zou worden aangetoond door de toename en afname van de expressie van het fluorescerende reportereiwit dat na de ontwikkeling door CIS-regulatoire elementen wordt aangestuurd. Deze procedure baande de weg voor onderzoekers op het gebied van genregulatie om het functionele belang te onderzoeken dat cis-regulatoire elementmotieven en geëvolueerde mutaties hebben voor de genexpressie.