Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek
20 september 2011
Dit artikel beschrijft een methode om nanoprecipitation op basis van polymeren nanodeeltjes door middel van diblok co-polymeren te synthetiseren. Bespreken we de synthese van diblok co-polymeren, de nanoprecipitation techniek en mogelijke toepassingen.
Het algemene doel van deze procedure is het synthetiseren van polymere nanodeeltjes met behulp van een nanoprecipitatiemethode. Dit wordt bereikt door eerst een E-D-C-N-H-S-reactie uit te voeren om A-P-L-G-A PEG-copolymeer te genereren. Het PLGA PEG-copolymeer wordt vervolgens gebruikt om nanodeeltjes te genereren, waarbij het betreffende geneesmiddel of de lading via nanoprecipitatie wordt ingekapseld.
Op dit punt kan een basis biofysische karakterisering worden uitgevoerd, waaronder de grootte, oppervlaktelading en de efficiëntie van de drugslading, middels dynamische lichtverstrooiing, transmissie-elektronenmicroscopie of HPLC. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van tumoren, aangezien de nanodeeltjes slecht oplosbare antikankertherapeutica kunnen afleveren, wat effectiever kan zijn dan huidige behandelingen. Deze methode kan zodoende inzicht bieden in de behandeling van kanker.
Het kan ook worden gebruikt om andere systemen te bestuderen, zoals cellulair transport. De nanodeeltjes kunnen worden geconjugeerd met een targetligand en in vivo of in vitro worden gevisualiseerd met behulp van een beeldvormingsmiddel ter demonstratie van de techniek. Vandaag worden twee technici uit ons laboratorium, Rohit Sukumar en Natalie Cummings, aanwezig zijn. Om de synthese van het PLGA PEG-copolymeer te starten, lost u carboxylaat-PLGA op in acetonitril met een concentratie van 5 mM onder voorzichtig roeren.
Voeg vervolgens voldoende NHS en EDC toe om concentraties van 25 millimolar te verkrijgen, wat een vijfvoudig stoichiometrisch overschot oplevert ten opzichte van PLGA. Roer de oplossing voorzichtig gedurende ongeveer één uur om de PLGA-carboxylaten om te zetten in PGA-NHS. Precipiteer na één uur het PGA-NHS-reactieproduct door de wasoplossing methanol toe te voegen in een volume van ongeveer 10 keer het volume van de oplossing. Centrifugeer de oplossing bij 2000 ×g om het P-L-G-A-N-H-S te pelletiseren. Gooi na centrifugatie de supernatant weg om sporen van EDC en NHS te verwijderen. Deze procedure van wassen met methanol wordt ten minste drie keer herhaald.
Nadat het wassen is voltooid, wordt de P-L-G-A-N-H-S gedurende 30 minuten onder vacuüm gedroogd om alle resten van de wasoplossing te verwijderen. Los nu de P-L-G-A-N-H-S-pellet opnieuw op in aceto NI trial in dezelfde concentratie als die aanvankelijk werd gebruikt om de PLGA op te lossen.
Zodra dit is opgelost, wordt heterobifunctionele PEG aan de PLGA-oplossing toegevoegd. Voeg een concentratie van vijf millimolar toe.
Incubeer de mengoplossing gedurende 24 uur onder constant roeren. Precipiteer het reactieproduct van het PLGA PEG-blokcopolymeer door een overmaat aan methanol toe te voegen. Voer het was- en centrifugeerproces nog drie keer uit om alle overtollige niet-gereageerde PEG te verwijderen.
Als laatste stap in de synthese wordt het PLGA PEG-blokcopolymeer onder vacuüm gedroogd. De nanopartikelprecipitatie begint met het oplossen van het PLGA PEG-blokcopolymeer en het te encapsuleren geneesmiddel in een A-P-L-G-A-oplosmiddel. De keuze van het oplosmiddel is cruciaal, omdat dit de eigenschappen van het nanopartikel beïnvloedt. Voeg vervolgens het polymeer-geneesmiddelmengsel druppelsgewijs toe aan drie tot 10 volumes geroerd water om een uiteindelijke polymeerconcentratie van ongeveer 3 mg/mL te verkrijgen. Druppelsgewijs.
De toevoeging van de organische oplossing aan de waterige fase is essentieel voor de vorming van nanodeeltjes met de juiste grootte. Zet het roeren nog twee uur voort onder verminderde druk om de nanodeeltjes via zelfassemblage te laten vormen en sporen van het organische oplosmiddel te verwijderen. Na twee uur roeren.
Concentreer de nanodeeltjes door centrifugatie bij 2.700 ×g gedurende 10 minuten met behulp van een Amon-filter. Was de nanodeeltjes vervolgens met PBS om niet-ingekapseld geneesmiddel te verwijderen, gevolgd door centrifugatie. Resuspendeer de nanodeeltjes op dit punt in PBS.
Basis biofysische karakterisering, waaronder grootte, oppervlaktelading en drugloading-efficiëntie, kan worden uitgevoerd om de eigenschappen van de nanodeeltjes beter te begrijpen. De nanodeeltjes kunnen worden bewaard zoals beschreven in het geschreven protocol; om de PLGA PEG-nanodeeltjes te karakteriseren, werd transmissie-elektronenmicroscopie gebruikt om de grootte, distributie en structuur van de nanodeeltjes te bevestigen. De deeltjesgrootte bevindt zich over het algemeen in het nanometerbereik.
Grote partikelgroottes met een ongelijkmatige grootteverdeling kunnen wijzen op een fout in de conjugatiereactie of erop dat de nanoprecipitatiemethode geoptimaliseerd moet worden. Hier wordt een studie naar de kinetiek van de geneesmiddelafgifte getoond, waarbij de laadefficiëntie en afgifte van Paclitaxel zijn gekwantificeerd met standaard HPLC. Bekende, vaste hoeveelheden van de nanodeeltjes werden gedialyseerd op vaste tijdsintervallen.
De inhoud van de dialyse-eenheid werd verzameld en er werd een gelijk volume organisch oplosmiddel toegevoegd om de nanodeeltjes op te lossen. Vervolgens werd er HPLC uitgevoerd op deze monsters. Om de hoeveelheid Paclitaxel te kwantificeren; zodra men deze nanoneerslagtechniek beheerst, kan deze binnen drie uur correct worden uitgevoerd.
Houd er bij het uitvoeren van deze techniek rekening mee om de organische fase altijd langzaam aan de waterige fase toe te voegen om de vorming van grote deeltjes na de ontwikkeling te voorkomen. Deze techniek baande de weg voor kankeronderzoekers op het gebied van nanomedicijnen om het gebruik van slecht oplosbare geneesmiddelen te verkennen die voorheen als te toxisch werden beschouwd bij kankerpatiënten na deze procedure. Andere methoden, zoals in vivo effectiviteitsstudies of beeldvormingsstudies, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals of slecht oplosbare geneesmiddelen effectief zijn wanneer systemische toxiciteit geen probleem meer is, of dat targetingsliganden nanodeeltjes correct naar hun bestemming sturen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het synthetiseren van polymere nanodeeltjes met behulp van een nanoprecipitatietechniek. De focus ligt op de synthese van diblok-copolymeren en hun potentiële toepassingen bij geneesmiddelentoediening, in het bijzonder voor anti-kankertherapie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Nanotechnologie
- Polymeerchemie
- Drugdeliverysystemen
Achtergrond
- Polymere nanodeeltjes kunnen geneesmiddelen inkapselen voor gerichte toediening.
- Diblock-copolymeren zijn essentieel voor het creëren van deze nanodeeltjes.
- Nanoneerslag is een belangrijke techniek voor de synthese van deze deeltjes.
- Deze methode kan de oplosbaarheid van slecht oplosbare geneesmiddelen verbeteren.
Doel van de studie
- Het synthetiseren van polymere nanodeeltjes met behulp van een nanoneerslagmethode.
- Het onderzoeken van de inkapseling van therapeutische middelen binnen deze nanodeeltjes.
- Het evalueren van het potentieel van deze techniek bij kankertherapie.
Gebruikte methoden
- E-D-C-N-H-S-reactie voor het genereren van A-P-L-G-A PEG-copolymeer.
- Nanoprecipitatietechniek voor de synthese van nanodeeltjes.
- Dynamische lichtverstrooiing voor groottekarakterisering.
- Transmissie-elektronenmicroscopie voor structurele analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van PLGA PEG-copolymeer.
- Karakterisering van nanodeeltjes toonde gunstige eigenschappen wat betreft grootte en lading.
- Aangetoonde inkapselingsefficiëntie voor geneesmiddelentoediening.
- Potentiële toepassingen bij het toedienen van therapeutica tegen kanker.
Conclusies
- De nanoprecipitatiemethode is effectief voor de synthese van polymere nanodeeltjes.
- Deze techniek kan de afgifte van slecht oplosbare geneesmiddelen verbeteren.
- Verder onderzoek is nodig om het volledige therapeutische potentieel te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze nanoprecipitatiemethode maakt de formulering van diblok polymere nanodeeltjes mogelijk voor het inkapselen van slecht oplosbare therapeutica, waarmee een belangrijke uitdaging in de drugdelivery bij oncologie wordt aangepakt. Door de oplosbaarheid te verbeteren en de toxiciteit van het oplosmiddel te verminderen, ondersteunt deze techniek de preklinische evaluatie van cytotoxische verbindingen zoals paclitaxel en wortmannine. Het biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor targetvalidatie en lead-optimalisatie in nanomedische pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt formulering mogelijk van slecht oplosbare geneesmiddelen voor mechanistische studies naar cytotoxische routes.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van toxische oplosmiddelen zoals DMSO, wat de compatibiliteit van assays en de cellevensvatbaarheid verbetert.
- Predictieve waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targets door effectieve afgifte van hydrofobe liganden en remmers mogelijk te maken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert uniforme nanodeeltjes met aanpasbare grootte en oppervlaktelading voor reproduceerbare screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van eenvoudige nanoprecipitatie in waterig milieu, waardoor high-throughput preparatie mogelijk is zonder gespecialiseerde apparatuur.
- Klaar voor assay: Levert een consistente efficiëntie van drug loading, wat cruciaal is voor de nauwkeurigheid van de dosis-respons in fenotypische screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert studies naar intracellulair transport via inkapseling van fluorescerende kleurstoffen en real-time tracking.
- Operationele waarde: Maakt conjugatie van targetliganden aan het PEG-oppervlak mogelijk voor epitooispecifieke cellulaire labeling.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de overgang van in vitro validatie naar in vivo effectiviteits- en beeldvormingsstudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de overgang van vroege ontdekking naar preklinische fase, waardoor solubilisatie van leadverbindingen voor functionele testen en formulatieoptimalisatie mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door slecht oplosbare modulatoren af te leveren om doelpaden te onderzoeken.
- Screening: Levert reproduceerbare nanodeeltjesformuleringen voor het screenen van verbindingenbibliotheken met gecontroleerde afgifte.
- Analytics: Maakt kwantificering van grootte, zetapotentiaal en inkapselingsefficiëntie mogelijk via DLS en HPLC.
- Translational Research: Verbindt met studies naar biodistributie en afgiftekinetiek voor evaluatie van de therapeutische index.
- Enterprise Reuse: Platform is aanpasbaar voor meerdere vrachten (geneesmiddelen, kleurstoffen, liganden) zonder herformulering.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellingsvertrouwen door de afgifte van mechanistisch relevante, slecht oplosbare stoffen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd proces zonder oplosmiddeluitwisseling verbetert de reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Vermindert uitval als gevolg van formulatiefalen tijdens lead-optimalisatie.
- Impact op portfolio: Maakt de voortgang van anders onbehandelbare kandidaten naar preklinisch onderzoek mogelijk.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in polymeerconjugatie en optimalisatie van nanoprecipitatie.
- Vereist dialyse, centrifugatie en HPLC of DLS voor karakterisering.
- Vereist strikte controle over de toevoegingssnelheid van de organische naar de waterige fase om aggregatie te voorkomen.
- Houd rekening met variabiliteit tussen polymeerbatches in de drug-loading en afgifteprofielen.
- Beperkt door de hydrofobiciteitsdrempel van de vracht; sterk hydrofiele payloads worden mogelijk niet efficiënt ingekapseld.
