Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

In deze video worden kinase- en fosfataseactiviteiten gedurende de gehele celcyclus gemonitord met behulp van Förster-resonantie-energietransfer of FRET. Hier is een probe voor de activiteit van polo-like kinase 1 of PLK1, waarbij een cyaan fluorescent protein (CFP) aan het ene uiteinde is geplaatst en een geel fluorescent protein (YFP) aan het andere uiteinde. Deze probe wordt getransfecteerd in U2 OS-cellen.

Om vervolgens de fosforyleringsstatus van LK-doelwitten tijdens de G2-M-overgang te onderzoeken, worden de getransfecteerde U2 OS-cellen onderworpen aan fluorescence time-lapse imaging. Wanneer CFP en YFP zich in nauwe nabijheid bevinden en CFP wordt geëxciteerd, wordt energie overgedragen naar YFP en kan YFP-emissie worden gedetecteerd. Echter, wanneer de probe gefosforyleerd raakt, zorgt een conformationele verandering in het eiwit ervoor dat CFP en YFP van elkaar gescheiden worden.

Wanneer CFP nu wordt geëxciteerd, worden een sterke CFP-emissie en slechts een zwakke YFP-emissie gedetecteerd; kwantificering van de ratio van de YFP-emissie na zowel CFP- als YFP-excitatie toont aan dat de PLK1-activiteit toeneemt in G2 en piekt tijdens de mitose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard geometrische filming, is dat er specifiek aandacht voor is dat de celcyclus niet wordt verstoord door noch de filmingcondities, noch door de expressie van een sonde. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celcyclus, zoals waar en wanneer specifieke kinasen of fosfatasen worden geactiveerd.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in enzymen die door de celcyclus worden gereguleerd, kan ze ook worden toegepast op andere systemen waarbij ongesynchroniseerde condities vereist zijn, zoals celproliferatie-assays. Om de menselijke celcyclus te monitoren, worden U2 OS-cellen getransfecteerd met een FRET-gebaseerde PK1-activiteitssonde. Met behulp van een standaard calciumfosfaat-transfectiemethode worden de cellen gedurende ten minste zeven dagen geselecteerd in purmycine.

Dit verrijkt de populatie cellen die de probe tot expressie brengen en beperkt het aantal cellen met toxische expressieniveaus of expressieniveaus die de celcyclus ernstig beïnvloeden. Stabiele klonen worden vervolgens geselecteerd via beperkte verdunning; de expressie van CFP en YFP wordt daarna onderzocht om te verifiëren dat deze in alle cellen in ongeveer dezelfde verhouding aanwezig zijn. Indien sommige cellen alleen CFP of YFP bevatten, heeft er waarschijnlijk recombinatie plaatsgevonden; herhaal in dat geval de plasmidpreparatie met bacteriën die minder vatbaar zijn voor homologe recombinatie, zoals suretwo-cellen, lineariseer vervolgens het plasmid en herhaal de transfectie.

Zodra de cellen de probe stabiel tot expressie brengen, zaait u ze uit op glazen bodemschaaltjes met nummer 1,5 nadat ze zijn gehecht en 30 tot 50% confluent zijn. Vervang het medium door een CO2-onafhankelijk medium dat geen fenolrood bevat en plaats de cellen op een gemotoriseerde epifluorescentiemicroscoop met temperatuurregeling ingesteld op 37 °C. De microscoop dient te zijn uitgerust met excitatie- en emissiefilters voor CFP en YFP.

Een ROIC-spiegel die geschikt is voor het monitoren van CFP en YFP en een objectief dat geschikt is voor de vereiste resolutie. Hier wordt een 20 x NA 0.75 luchtobjectief gebruikt. Breng de cellen in focus met behulp van doorgelaten licht.

Gebruik op dit punt geen fluorescent licht, aangezien dit een stressrespons zal induceren die de celcyclus kan verstoren. Om fototoxiciteit te voorkomen, stelt u de buiging in op de maximale beschikbare waarde die de vereiste subcellulaire resolutie toelaat. Voor dit experiment moet het mogelijk zijn om de nucleus en het cytoplasma te onderscheiden.

Stel een korte belichtingstijd in en plaats een neutraal dichtheidsfilter met een hoge waarde. Neem vervolgens een testbeeld van 12 of 16 bits op. Pas met behulp van YFP-excitatie en -emissie de belichtingstijd en de neutraal dichtheidsfilters aan, zodat de gemiddelde intensiteit in een cel ongeveer gelijk is aan de achtergrondintensiteit plus vijf keer het verschil tussen de minimale en maximale achtergrondintensiteiten. Controleer de fluorescentie-intensiteit van het monsterbeeld om te verifiëren dat de beelden niet verzadigd zijn.

De maximale intensiteit in het beeld moet minder dan de helft van het dynamisch bereik bedragen om intensiteitsverschillen op te vangen wanneer cellen de mitose ingaan. Herhaal vervolgens dit proces met behulp van CFP-excitatiefilters en YFP-emissiefilters. Selecteer meerdere regio's met getransfecteerde cellen, met uitzondering van de regio's die zijn gebruikt voor het scherpstellen en het optimaliseren van de belichtingscondities.

Aangezien deze procedures een stressrespons kunnen hebben opgeroepen, moet worden gecontroleerd of de maximale intensiteit in alle cellen minder dan de helft van het dynamische bereik bedraagt. Stel de software in om elke 45 minuten twee beelden vast te leggen met YFP-excitatie, YFP-emissie en CFP-excitatie. YFP-emissiefilters.

Stel daarnaast de totale duur van het experiment zo in dat deze langer is dan de duur van de celcyclus. Zodra alles is ingesteld, start u met het vastleggen van de beelden. Nadat de acquisitie is voltooid, opent u de verkregen beelden en volgt u de celcyclusduur van mitose tot mitose. Voor cellen die hier de getransfecteerde probe tot expressie brachten, was de celcyclusduur ongeveer 20 tot 25 uur.

Vergelijk dit met controledata voor het gebruikte celtype. Als de celcyclusduur overeenkomt met de referentietijden, kan FRET worden geanalyseerd. Zodra de timing is geverifieerd, kunnen de beelden worden geanalyseerd.

De analyse kan worden uitgevoerd met de meeste software die specifiek voor microscopie is ontwikkeld. Hier wordt het gratis programma Image J gebruikt met de Ratio Plus-plugin. Begin de analyse door de afbeeldingen in Image J te openen. Als de afbeeldingen in een multicolor stack-formaat zijn, scheid dan de individuele kanalen door ze via de optie 'image' om te zetten naar een hyperstack.

Kies vervolgens Hyperstack en daarna Stack naar Hyperstack. Het venster 'Convert to Hyperstack' opent met de getoonde instellingen; klik op OK. De afbeelding wordt nu weergegeven met twee schuifregelaars eronder.

Klik vervolgens om de afbeeldingen in enkelkanaals stacks te splitsen op image en selecteer hyper stack reduce dimensionality. Dit opent het venster reduce; zorg ervoor dat frames en keep source zijn geselecteerd. Klik daarna op Okay.

Er verschijnt een nieuwe afbeelding die slechts één kanaal bevat. Herhaal dit proces om een nieuwe afbeelding met het tweede kanaal te openen. Selecteer vervolgens de YFP excitation YFP emission stack om de visuele helderheid van de uiteindelijke afbeeldingen te vergroten.

Klik op process en vervolgens op math. Klik daarna op multiply. Wanneer het venster voor multiply opent, voert u drie in om de YFP excitation YFP emission stack met drie te vermenigvuldigen. Deze stap is optioneel en zorgt ervoor dat ratio's niet in het bereik tussen nul en één liggen.

Select vervolgens de vrijehand-tool in de werkbalk van ImageJ. Teken vervolgens in de YFP-excitatie, YFP-emisieset een regio van interesse (ROI) in een gebied waar geen cellen aanwezig zijn, maar dat zich dicht bij een te meten cel bevindt. Klik op Analyse Tools en vervolgens op ROI Manager om de ROI aan de ROI-manager toe te voegen.

Het ROI-beheervenster verschijnt. Klik op 'add' om de ROI-coördinaten op te slaan voor het meten van de gemiddelde intensiteit van de ROI in de YFP-excitatie YFP-emissie stack. Klik op 'analyze' en selecteer vervolgens 'measure'.

Het resultatenvenster wordt geopend. Selecteer de stack met CFP-excitatie en YFP-emissie. Dubbelklik vervolgens op de ROI in de ROI-manager en voer de meting opnieuw uit.

De meting wordt aan het resultatenvenster toegevoegd. Scroll naar andere posities in de stack om dit proces bij meerdere tijdstippen te herhalen. Controleer of de achtergrondintensiteiten in de buurt van de cel van belang gedurende de hele film vergelijkbaar zijn door de metingen in het resultatenvenster te vergelijken.

Om de metingen zo in te stellen dat de minimale intensiteit wordt meegenomen, klikt u op analyze, vervolgens op set measurements en geeft u de minimale en maximale grijswaarde op. Vervolgens verschijnt er een venster met meetalternatieven. Pas indien nodig de helderheid en het contrast aan, trek een ROI die het grootste deel van een cel beslaat en meet de minimale intensiteit in beide stacks.

Voer vervolgens metingen uit zoals voorheen, maar gebruik nu een cel in plaats van de achtergrond. Bereken op basis van de waarden uit de resultatensecties het verschil tussen de gemeten minimale intensiteit en de achtergrondintensiteit en deel dit door twee. Dit geeft een eerste schatting voor de clipping-waarde voor de open ratio plus select plugins.

Kies vervolgens ratio plus. Selecteer voor de FRET-ratio vervolgens de CFP-excitatie YFP-emissie S-stack 1, of voor de inverted FRET-ratio bij het visualiseren van probes waarbij de FRET-efficiëntie afneemt bij fosforylering: selecteer de YFP-excitatie YFP-emissie S-stack 1 om de gemeten achtergrondintensiteiten en clipping-waarden in te voeren.

Gebruik de waarden uit het resultatenvenster en plak deze in het venster Ratio Plus. Stel de schaling van de resulterende ratio-stack in en pas een geschikte lookup-tabel toe om ratio-veranderingen te visualiseren. U2 OS-cellen die een FRET-gebaseerde probe tot expressie brachten om de PLK1-activiteit te monitoren, werden gedurende 60 uur gefilmd zoals beschreven in deze video.

Deze afbeelding laat de cumulatieve mitotische entry zien van 50 cellen die de fret-probe tot expressie brengen, inclusief delingen van dochtercellen. De meerderheid van de cellen die de probe tot expressie brengen, prolifereert met een celcyclusduur tussen de 20 en 25 uur, wat aangeeft dat de beeldvormingscondities en expressieniveaus van de probe de timing van de celcyclus niet beïnvloeden. Een vals-kleurenweergave van de geïnverteerde fret-ratio, waarbij één cel door vier delingen wordt gevolgd, laat zien dat er ondanks aanzienlijke ruis een trend zichtbaar is waarbij de PK1-activiteit toeneemt in G2 en piekt tijdens de mitose.

Wanneer de ruwe gegevens met een gemiddeldefilter worden behandeld en als grafiek worden weergegeven, is de tijd tussen de activiteitspieken eenvoudig te schatten. Deze figuur toont de kwantificering van de omgekeerde FRET-ratio van de cel uit de vorige beelden op basis van de grafiek. De timing van de activering kan worden geschat en, zoals hier te zien is, wordt de fosforylering van de probe zichtbaar ongeveer vier uur voordat de fosforylering zijn piek bereikt tijdens de mitose.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cellen in een stressvrije toestand te houden; dit wordt bereikt door de blootstelling aan licht te minimaliseren en schommelingen in temperatuur of pH te beperken. Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat deze methode het evenwicht tussen kinase- en phosphatase-activiteit in een cel monitort. Deze procedure kan worden gecombineerd met RNA-interferentie of inhibitor-screens om de upstream-regulatoren van deze kinases en phosphatases te identificeren.