Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Deze procedure maakt het mogelijk om de celdood van oligo DDR-gliacellen in real-time te monitoren. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te kweken, waarna de cellen worden voorbereid voor live-cell imaging. De volgende stap is het behandelen van de cellen en het monitoren van de effecten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

De laatste stap is het uitvoeren van de data-analyse. Uiteindelijk tonen de resultaten de sterftecijfers van cellen in een celpopulatie na een behandeling of stimulus door de nucleaire fluorescentie van een caspase-geactiveerde fluorescente kleurstof te monitoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunokleuring is de mogelijkheid om gelijktijdig meerdere tijdspunten vast te leggen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de celbiologie, zoals reacties op farmacologische behandelingen, reagentia en diverse andere behandelingen. Momenteel kan deze methode inzicht bieden in celdood binnen celculturen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals ex vivo organotypisch weefsel, waaronder hersensnijden.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben bij de overgang van het werken met gefixeerd weefsel naar levend weefsel. Een visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk, aangezien er veel meer stappen nodig zijn voor het voorbereiden van levende celmonsters in vergelijking met gefixeerd weefsel. Ontdooi eerst bevroren geïmmortaliseerde N 19 oligo droog gliale cellen in een waterbad van 37 °C terwijl de cellen ontdooien.

Voeg zeven milliliter high glucose DMEM, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine, toe aan een kweekschaal van 10 centimeter. Voeg vervolgens de cel-suspensie druppelgewijs toe aan de plaat en schud de Petrischaal voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Kweek de cellen vier uur lang bij 34 graden Celsius in een incubator met 5 procent koolstofdioxide.

Aspireer het medium uit de platen om eventuele resterende DMSO-cryoprotectant te verwijderen. Vervang dit na vier tot zeven dagen groei door zeven milliliter vers medium. Wanneer de cellen een confluentie van 70 tot 80% hebben bereikt, aspireer dan het medium en pipetteer één milliliter druppels op de cellaag, en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Oogst vervolgens de cellen en zaai ze in een weefselkweekschaal van 10 centimeter met de geoogste cellen bij een dichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen per milliliter, en plaats deze schaal in de weefselkweekincubator. Na nog één passage kunnen de cellen worden uitgeplaat voor live-cell imaging-experimenten. Hiervoor oogst u de cellen zoals voorheen, neem dan 30 µL van de celsuspensie en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.

Plaats vervolgens met steriele pincetten onbehandelde glazen dekglasjes. Voeg in de wells van een six-well plaat cellen toe aan de well met een dichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen per milliliter. Laat de cellen vóór transfectie overnacht groeien bij 34 °C en 5% CO2 in twee milliliter fenolvrij DMEM high glucose medium, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.

Combine de volgende dag 100 µL serumvrij medium, 0,5 tot 4 µg gezuiverd plasmid-DNA en 4 µL FUgene HD. Vortex het mengsel voorzichtig twee keer en laat het DNA vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur complexeren. Wanneer de incubatietijd is verstreken, voegt u het FUgene HD-DNA-mengsel direct toe aan de gekweekte cellen.

Kantel de plaat voorzichtig om te mengen. Kweek de cellen vervolgens nog 48 uur bij 34 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voorafgaand aan de behandeling of experimenten. Zet eerst de controlebox van het LCI Cham light live cell instrument aan.

Dit dient drie uur voordat het experiment begint te gebeuren om een grondige opwarming van de objecttafel te garanderen. De bedieningskast moet in ieder geval één uur voor de start van het experiment worden ingeschakeld. Spuit vervolgens, terwijl u in een laminaire flowkast werkt, de LCI Cham light magnetische kweekkamer en de pincet in met 70% ethanol en laat deze vijf minuten drogen.

Haal de cellen uit de incubator en onderzoek ze onder de microscoop om te bevestigen dat ze gezond zijn. De cellen moeten er turgid uitzien en goed verspreid zijn op het glazen dekglas, met talrijke membraanuitlopers. Cellen met een verminderd aantal procesuitlopers of een onregelmatig gevormde kern zijn waarschijnlijk gestrest door de transfectie en zijn ongeschikt voor verdere experimenten in de laminaire flowkast.

Kantel de zeswellenplaat en verwijder het dekglas met een pincet. Plaats het dekglas snel met de celzijde naar boven in de bodemplaat van de kamer. Laat het dekglas niet uitdrogen.

Bevestig vervolgens het magnetische hoofdlichaam van de kweekkamer en voeg 500 µL medium uit de oorspronkelijke zes-wellplaat toe aan de bovenkant van het dekglas. Het hergebruiken van het medium vermindert de stress voor de cellen die wordt veroorzaakt door omgevingsveranderingen en kan ook nuttig zijn voor het beoordelen van extracellulair uitgescheiden factoren. Nadat het medium is toegevoegd, wordt het glazen kap op de kweekkamer geplaatst en wordt een Kim wipe met 70% ethanol gebruikt om eventuele restmaterialen van de onderkant van het dekglas te verwijderen die de microscopie kunnen hinderen.

Plaats de kweekkamer gedurende 30 minuten in de incubator bij 34 °C en 5% koolstofdioxide. Deze stap zorgt ervoor dat de kamer zelf opwarmt tot 34 °C om verschuiving van het dekglas te verminderen. Terwijl het metaal opwarmt, is het noodzakelijk om tijdens de volgende stappen met een zo laag mogelijke omgevingsverlichting in de kamer te werken.

Ten eerste had Thora eerder een aliquoot van nuke view bij kamertemperatuur klaargezet. Haal vervolgens de kweekkamer uit de incubator en plaats deze snel in de omgevingskamer van de microscoop. Zet de 5% vooraf gemengde kooldioxidecilinder met dubbele regelaar aan.

Gebruik vervolgens het 10x objectief, waarbij de microscooplamp is ingesteld op ongeveer 2,5 volt en de belichtingstijd op 240 milliseconden. Focus met behulp van helderveldmicroscopie om de cellen op de computermonitor te visualiseren. Voeg daarna een concentratie van 80 millimol kaliumionen of een andere apoptose-induceerder toe aan de cellen via mediumwissel met langzame en lokale perfusie met behulp van een peristaltische pomp.

Het nuke view 4 88 substraat is stabiel in celkweek voor experimenten met een duur tot 36 uur. Daarom is het mogelijk om experimenten over deze tijdsperiode uit te voeren. Stel eerst de microscoop zo in dat fluorescentie van rood en groen fluorescerend eiwit gevisualiseerd kan worden.

Klik vervolgens op het rode kanaal om de getransfecteerde cellen weer te geven. Selecteer en sla ongeveer 12 frames op waarin meerdere getransfecteerde cellen zichtbaar zijn en sla deze XY-tabelposities op. Stel de microscoop zo in dat er elke zes minuten beelden in het brightfield-rode kanaal en het groene kanaal worden vastgelegd op deze opgeslagen posities.

Nadat meerdere XY-punten zijn verzameld uit dubbele of driedubbele experimenten, compileert u de gegevens van afzonderlijke experimenten die op verschillende dagen zijn uitgevoerd en voert u de data-analyse en statistische toetsing uit zoals beschreven in het geschreven protocol om de verhouding tussen negatieve CASP-bay-cellen en positieve CASP-bay-cellen te vergelijken. Nuke view 4 88-substraat kan wijzen op een verhoogde apoptosesnelheid van N 19-oligo DDR-gliale celculturen. Na een behandeling met een hoge extracellulaire kaliumconcentratie werden deze basislijnbeelden verkregen met een 10-voudig objectief.

De N 19-cellen werden getransfecteerd met RFP en behandeld met óf drie µL Nuke View 488-substraat voor de controlecellen, óf drie µL Nuke View 488-substraat en 80 mM kalium. Deze beelden illustreren dat het aantal apoptotische cellen in de loop van de tijd toeneemt, drie, zes en negen uur na behandeling met 80 mM kalium; onder controlecondities werden geen significante hoeveelheden apoptose waargenomen in vergelijking met de met 80 mM kalium behandelde culturen. Het groene achtergrondsignaal dat onder de controlecondities werd waargenomen, duidt op de cellen die apoptose ondergaan zonder de toevoeging van extracellulair kalium.

Een tijdscursus van 12 uur is adequaat voor studies naar neurologische beschadigingen. Na 12 uur vertoonden de met kalium behandelde culturen ongeveer 45% celsterfte. Vrijwel geen van de cellen in het controle-experiment vertoont apoptose op het tijdstip van 12 uur. Hoewel in andere situaties de experimenten wellicht langer moeten doorlopen.

Deze grafiek toont de toename van caspase three-positieve cellen gedurende het tijdsverloop van het 12-urige experiment. Eenmaal geoptimaliseerd kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd en kunnen de gegevens gedurende de nacht worden verzameld als dit correct wordt gedaan. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om consistent te blijven tussen de behandelingen na het volgen van deze methode.

Andere methoden, zoals immunokleuring, kunnen worden gebruikt om andere stroomafwaartse eiwitten te bestuderen die betrokken zijn bij de onderzochte signaalpaden. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u monsters voor beeldvorming voorbereidt. Verzamel een dataset en analyseer uw gegevens.