Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Hallo, ik ben Jersey. Hi, mijn naam is Shabi en wij zijn beiden postdoctoral onderzoekers aan het Imperial College London, waar we werken met professor Andrew Di Melo en dr. Josh Del aan microfluïdische druppelplatforms. Druppelgebaseerde microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor experimenten met een hogere doorvoer, omdat ze gegenereerd kunnen worden met zeer hoge, nauwkeurig gedefinieerde volumes en hun generatiefrequentie kan oplopen tot meerdere kilo's per seconde.

Bovendien kan, aangezien het gebied van interesse kan worden ingekapseld in compartimenten van slechts enkele liters, zowel crosstalk als dispersie worden geëlimineerd en kunnen analytische processen met grotere nauwkeurigheid worden getimed. In onze groep hebben we micro-druppelplatforms al met succes toegepast in talrijke applicaties. Denk hierbij aan de polymerasekettingreactie, nanodeeltjessynthese en de single molecular cell assay.

De grote hoeveelheden informatie die binnen deze systemen worden gegenereerd, moeten efficiënt worden geëxtraheerd, benut en aangewend. In dit opzicht moet de gekozen detectiemethode geschikt zijn, een hoge gevoeligheid en lage detectielimieten bieden, toepasbaar zijn op een reeks moleculaire soorten, niet-destructief zijn en op een eenvoudige manier kunnen worden geïntegreerd met microfluïdische apparaten. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we een reeks experimentele hulpmiddelen en protocollen ontwikkeld die de extractie van grote hoeveelheden fysieke informatie uit omgevingen met een klein volume mogelijk maken en toepasbaar zijn voor de analyse van een breed scala aan fysische, chemische en biologische aspecten.

In dit protocol presenteren we twee methoden die worden toegepast voor de detectie van enkelvoudige cellen en het in kaart brengen van mengprocessen in een droplet-systeem. Microfluïdische chips worden traditioneel gefabriceerd in polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van fotolithografische methoden. Dit proces dient te worden uitgevoerd in een cleanroom-faciliteit om microfluïdische kanalen te verkrijgen: spin SU-8 50 op een siliciumwafer, voer een soft bake uit op een hotplate bij 65 °C en 95 °C om het oplosmiddel te verdampen en de film te verdichten; belicht na afkoeling de SU-8 resist met UV-straling onder het juiste masker, en bak de wafer vervolgens bij 65 °C en 95 °C na afkoeling.

Ontwikkel de niet-belichte gebieden met de geschikte ontwikkelaar terwijl u roert. Gebruik vers EC-oplosmiddel om de wafer te spoelen en droog deze vervolgens onder gas om een schoon oppervlak te verkrijgen. Behandel de wafer met wassingen van hexaan en methanol.

Om het fabricageproces van de master voor de estates te voltooien, wordt er gedurende 40 minuten een fixatiemiddel in een desiccator op het oppervlak geëvaporeerd. Om gestructureerde microfluidische substraten te vormen, mengen we S guard 1 8 4 in een verhouding van 10:1 tussen hars en crosslinker en brengen we dit aan over de master. Ontgas dit in een desiccator en uithard het device bij 65 °C.

Snijd het uitgeharde PDMS door en pel het van de master af. Maak toegangsgaten voor de vloeistofslangen met een biopsietpons. Hard een andere laag PDMS 20 minuten uit bij 65 graden.

Plaats de voorbereide bovenlaag op de onderlaag en laat deze gedurende de nacht uitharden bij 65 °C. Pel de chips uit de Petrischaal en snijd ze in blokjes. Zodra de chips zijn gefabriceerd, kunnen ze worden gebruikt door de gewenste oplossingen te infuseren.

Vul de spuiten met de vereiste oplossingen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slangetjes achterblijven. Voor de generatie van druppels worden twee fasen gebruikt. De waterige gedispergeerde fase bevat de relevante reagentia.

De oliefase fungeert als de continue fase. Bevestig aan één uiteinde slangetjes met dezelfde binnendiameter als de naalden van de spuiten aan de naalden; plaats de spuiten op een spuitenpomp en stel de gewenste infusiesnelheid in. Voor elke fase wordt een minimale verhouding tussen de stroomsnelheden van olie en water van één aanbevolen om bevochtiging van het PDMS door de waterfase te voorkomen, wat zou leiden tot onstabiele druppelvorming. Verbind de andere uiteinden van de slangetjes direct met de gaten die in het PDMS-substraat zijn geponst.

Voor complexere oplossingen kunnen ook silica, capillaire poorten of connectoren worden geïmplementeerd. Verbind de uitlaatpoort van de chip met de slang en leid deze naar een opvangvat voor afvalverzameling of verdere analyseverwerking. Zodra dit is ingesteld, zijn er twee hoofdconfiguraties van microkanalen om druppels te genereren: flow-focusing of een T-junction-formaat, als gevolg van de schuifkrachten die ontstaan bij het gebruik van deze geometrieën om de twee toegelaten vloeistoffen samen te brengen en de daaropvolgende capillaire instabiliteiten die zich op het grensvlak ontwikkelen.

Er worden spontaan kleine, verspreide druppels van slechts enkele femtoliters gegenereerd. Zodra de druppels worden gegenereerd, kunnen deze worden onderzocht met een optische opstelling. De optische opstelling wordt volgens het volgende protocol ingericht.

Gebruik een confocale microscoop met een automatische submicron positioneringscapaciteit en een laser die werkt op een golflengte die overeenkomt met de absorptie van de betrokken fluorforen. Om deze te exciteren, wordt voor fluorescentie-levensduurbeeldvorming een pulslaser gebruikt met herhalingsfrequenties van enkele megahertz. Bij experimenten met slijm worden beamsteering-spiegels en optica gebruikt om zowel de straalhoogte als de straalrichting te regelen.

Gebruik een dichroïsche spiegel om de laserstraal naar de objectieflens te reflecteren. Als er twee lasers gelijktijdig worden gebruikt, kan een dual-band dichroïsche spiegel worden geïnstalleerd. Gebruik een oneindig gecorrigeerd microscoopobjectief met een hoge numerieke apertuur (NA) om de twee laserstralen te reflecteren en het laserlicht in een scherpe focus binnen een microfluïdisch kanaal te brengen.

Vang de door het monster in het microfluïdische kanaal uitgezonden fluorescentie op, met gebruik van hetzelfde objectief met hoge NA en transmissie via dezelfde dichroïsche spiegel. Verwijder eventueel resterend excitatielicht met een enkel- of dubbelbandig emissiefilter. Focus de fluorescentie-emissie op een pinhole van 75 micrometer.

Maak gebruik van een plano-convexe lens. Positioneer het pinhole in het confocale vlak van het microscoopobjectief. Gebruik een andere dichroïsche spiegel om het fluorescentiesignaal over twee detectoren te splitsen.

Filter de door de dichroïsche spiegel gereflecteerde fluorescentie met een emissiefilter en focus deze met een vlakbolle lens op de eerste detector. Voor experimenten met een secundaire rode fluorvoor, filter de door de dichroïsche spiegel getransmitteerde fluorescentie met een ander emissiefilter en focus deze vervolgens met een andere vlakbolle lens op de tweede detector. Gebruik avalanche-fotodiodes voor de detectie van fluorescentiefotonen.

Koppel voor de acquisitie van fluorescentiegegevens het elektronische signaal van de avalanche-fotodiodedetector aan een multifunctioneel DAQ-apparaat voor gegevensregistratie op een personal computer. Gebruik voor experimenten met slijm een gepulseerde laser en verbind de detectoren met een tijdgecorreleerde single-photon-counting (TCS) PC-kaart op een aparte pc. Met deze kaart kunnen fluorescentielevetijdsgegevens worden verkregen.

Er wordt gebruikgemaakt van een TCS PC-methodologie. Elk gedetecteerd fluorescent foton wordt gecorreleerd aan een invallende laserpuls, waardoor aan elk uitgezonden fluorescent foton een vertragingstijd wordt toegewezen. Deze gegevens kunnen worden gefit aan een enkelvoudige of meervoudige exponentiële vervalkurve om een schatting van de radiatieve snelheid van de fluorofoor te verkrijgen.

We weten inmiddels dat cellen zeer heterogeen zijn vanuit zowel biologisch, fysisch als chemisch perspectief. Daarom zouden we idealiter elke cel afzonderlijk moeten analyseren. De assays moeten echter met een hogere doorvoersnelheid worden uitgevoerd, zodat we voldoende kwantitatieve informatie kunnen verzamelen om tot een betrouwbare en betekenisvolle conclusie te komen.

Hier hebben we een voorbeeld van het inkapselen van e coli-cellen in een enkele druppel, zodat dit kan worden uitgevoerd. Gebruik de e coli top 10-stam die gedurende de nacht is gekweekt. Om de levensvatbaarheid van de cellen aan te tonen, gebruikt u cyto nine en propidiumjodide.

Beide kleurstoffen zijn DNA-intercalerende kleurstoffen en hun fluorescentie-intensiteit neemt met meer dan 20 keer toe. Na binding aan DNA is cyto nine een groen fluorescerende kleurstof die door membranen kan dringen, terwijl propidiumjodide een rood fluorescerende kleurstof is die niet door membranen kan dringen.

Hierdoor fluoresceren levende cellen groen, terwijl dode cellen zowel groene als rode emissies vertonen. Hier kunnen we de druppelgeneratie en de inkapseling van een enkele cel met een T-verbinding zien. Deze video is opgenomen met een hogesnelheidscamera, maar druppels kunnen met een snelheid van duizenden per seconde worden gegenereerd.

Bij het inkapselen van cellen moet men ervoor zorgen dat de celcultuur zodanig wordt verdund dat er minder cellen zijn dan er druppels worden gegenereerd, en dat sedimentatie van de cellen wordt voorkomen, wat kan gebeuren in de spuit of de slang. Gebruik een magnetische roerstaf in de spuit om de cellen gelijkmatig in de oplossing verdeeld te houden. Gebruik zeer dunne slang, 50 micrometers, om de spuit met de microchip te verbinden.

Dit zorgt voor een hoge stroomsnelheid in de slang en voorkomt zo dat de cellen bezinken. Hier zijn typische voorbeelden van fotontellingen als functie van de tijd voor de celgebaseerde experimenten. Om mengprocessen binnen druppels in kaart te brengen.

Druppels kunnen worden gegenereerd met behulp van twee verschillende fluorforen met verschillende levensduren. Binnen een stromende druppel wordt een stromingsveld gegenereerd, dat uiteindelijk de twee oorspronkelijk gescheiden oplossingen mengt om het mengproces te verbeteren. De symmetrie van het stromingsveld kan worden gewijzigd door kronkelende kanalen te gebruiken.

Om de druppels te onderzoeken, wordt het volume van de optische probe gefocust op de helft van de hoogte van een microkanaal waarlangs druppels stromen; begin aan één zijde van het kanaal en voer elk experiment uit over de gehele breedte van het kanaal met intervallen van één micrometer. Implementeer een algoritme om individuele bursts die geassocieerd zijn met druppels te onderscheiden van de ruisachtergrond van de olifase en om de duur van elke burst vast te stellen.

Implementeer een tweede algoritme om de vertragingstijd en intensiteitswaarden langs de lengte van elke druppel te extraheren bij de specifieke breedte waarop het experiment is uitgevoerd. Gebruik vervolgens een maximum likelihood estimator (MLE) algoritme om de fluorescentielevensduur van elke druppel in het experiment te evalueren. Door de levensduurwaarden voor alle druppels in het experiment te middelen, wordt de uiteindelijke fout van de MLE-berekening verkleind.

Hoe meer druppels er worden onderzocht, hoe kleiner de fout zodra er een levensduurstraject is verkregen. Combineer voor elke breedte alle trajecten in een 2D-kaart. Aangezien elke levensduurwaarde is gekoppeld aan een specifieke mengeling van de twee fluorescente markers, kan op deze wijze een concentratie- of mengingskaart worden opgesteld.

We hebben de vervaardiging van een micro-apparaat en een experimentele opstelling beschreven, samen met de bijbehorende protocollen voor de vorming van microdruppels, de inkapseling van regio's en de optische detectie van het proces, de druppels. De twee geselecteerde voorbeelden zijn de detectie van enkelvoudige cellen in druppels en het in kaart brengen van mengprocessen. Binnen de stromende druppel vertegenwoordigen dit veelvoorkomende toepassingen die momenteel worden onderzocht met druppelmicrofluidica.

Zoals de gepresenteerde experimenten illustreren, vertoont het gebruik van druppel-microfluidische platforms bepaalde aantrekkelijke kenmerken, zoals een hoge doorvoer door de perfecte inkapseling en een hogere reproduceerbaarheid. De grote hoeveelheid geproduceerde informatie en de hoge snelheid waarmee deze informatie wordt gegenereerd, vereisen het gebruik van snelle detectiemethoden met een maximale spatiotemporele resolutie om het volledige voordeel van deze geminiaturiseerde platforms te benutten.

In dit geval tonen we aan dat dit mogelijk is met behulp van zeer nauwkeurige fluorester spectroscopische technieken.