Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Het algemene doel van het volgende experiment is het synthetiseren van met alkylaat gestabiliseerde goudnanodeeltjes, bekend als monolayer protected clusters of MPC's, en het assembleren van deze materialen in dunne-filmassemblages die worden gebruikt als absorptie-interface voor azarine-proteïnemonolaag-elektrochemie. Dit wordt bereikt door goudcolloïden eerst te beschermen met organische liganden om goudnanodeeltjes te creëren die zijn omgeven door een alkaanfosfaatfilm. Vervolgens worden de MPC's verankerd aan goud- en glassubstraten en gevormd tot netwerken van dunne, covalent gekoppelde meerlaagse films, waarvan de groei wordt gevolgd via optische en elektrochemische metingen, evenals dwarsdoorsnedemicroscopie.

Vervolgens wordt het elektronentransporteiwit azarin geadsorbeerd aan het grensvlak en wordt cyclische voltammetrie uitgevoerd voor de elektrochemie van de eiwitmonolaag. De resultaten tonen aan dat de MPC-filmgrensvlakken die met deze procedure zijn gecreëerd, een meer geoptimaliseerde elektrochemische analyse van geadsorbeerd eiwit mogelijk maken op basis van de MPC-film, waarbij een homogener adsorptiegrensvlak en een snelle elektronentransferkinetiek worden geboden die geen traditionele afhankelijkheid van de afstand vertonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele eiwitelektrochemie is dat elektroden die zijn gemodificeerd met nanodeeltjesfilms een adsorptiegrensvlak bieden dat resulteert in een meer ideaal elektrochemisch gedrag, zoals gemeten door cyclische voltammetrie.

Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de synthese belangrijke visuele aanwijzingen bevat, terwijl de constructie en karakterisering van de film meerdere complexe stappen en analytische technieken omvatten. NPC-films kunnen worden samengesteld op gemodificeerde goudelektroden of glazen objectglaasjes door middel van een dipcyclusmethode met afwisselende MPC-lagen en dile-koppelingsmoleculen. Bijgevolg kunnen deze lagen elektrochemisch of optisch worden gevolgd tot een gewenste filmdikte.

Om goudclusters te synthetiseren onder een zuurkast met passende ventilatie, begin met het oplossen van 1,1 gram tetraethylammoniumbromide in 30 milliliter tolueen; los 0,38 gram natriumborhydride op in ongeveer 20 milliliter 18 mega ohm ultrapuur water en laat dit ten minste 30 minuten op ijs koelen. Breng vervolgens een oplossing van tetrachloorgoudzuur kwantitatief over in de tetraethylammoniumbromide-tolueenoplossing met behulp van nog eens vijf milliliter ultrapuur water. Om de waterige goudoplossing over te brengen naar de niet-waterige fase, wordt de kolf lichtjes afgesloten en gedurende 30 minuten krachtig geroerd.

Zorg ervoor dat de gebrande oranje waterige fase en de heldere niet-waterige fase goed gemengd zijn. Overbreng zowel de heldere waterige als de gebrande oranje niet-waterige fase naar een scheitrechter. Verwijder de waterige laag en decanteer de niet-waterige laag in een schone kolf.

Voeg C six toe in een verhouding van twee op één aan de niet-waterige oplossing die waterstof tetrachloruraat bevat. Roer gedurende 30 minuten om een goud(I)-polymeer te vormen, wat wordt aangetoond door een kleurverandering van roodoranje naar een bleekgele, bijna kleurloze oplossing. Breng het reactiemengsel over naar een geïsoleerd ijsbad en koel het onder roering gedurende ten minste 30 minuten af tot 0 °C. Voeg de gekoelde natriumborhydride-oplossing kwantitatief en snel toe aan het reactiemengsel om goud(I) te reduceren tot metallisch goud in de aanwezigheid van thighs.

Na toevoeging vormt zich onmiddellijk een dikke zwarte oplossing van monolayer-beschermde goudclusters of MPC's. Roer de reactie de volgende dag gedurende de nacht bij 0 °C. Overbreng het reactiemengsel naar een scheitrechter.

Giet de waterige laag af in een afvalbeker en zet de rotavap aan. Verdunstig de niet-waterige tolueenlaag tot bijna volledige droogte, zodat er een zware zwarte sludge in de kolf achterblijft. Precipiteer de MPC's door acetonitril toe te voegen en laat de oplossing een nacht staan met behulp van een glazen frit van gemiddelde porositeit met rubberen fittingen en een zijarmkolf met een aspirator.

Verzamel de MPC's door vacuümfiltratie en spoel ze met een grote hoeveelheid acetonitril. Nadat de sandwichcel elektrochemisch is geassembleerd, wordt het gouden substraat gereinigd door cyclische voltammetrie of CV uit te voeren in de potentiaalvensters van 0,2 tot 0,9 volt, 0,2 tot 1,2 volt en 0,2 tot 1,35 volt bij 100 millivolt per seconde in een oplossing van 0,1 molar zwavelzuur en 0,01 molar kaliumchloride. Meet de dubbellaags oplaadstroom van het gereinigde, naakte gouden substraat door CV uit te voeren onder standaardcondities, wat een potentiaalvenster van 0,1 tot 0,4 volt ten opzichte van zilver/zilverchloride omvat, gescand bij 100 millivolt per seconde in kaliumfosfaatbuffer of KPB.

Verwijder de buffer en spoel tweemaal grondig na met ultrapuur water en ethanol. Exposeer het gereinigde gouden substraat aan ongeveer 300 µL van een 5 mM C6-oplossing in ethanol en laat dit een nacht staan om een geordende C6-SAM te vormen. Verwijder de C6-oplossing uit de cel en spoel tweemaal grondig na met ethanol en ultrapuur water.

Meet de ladingsstroom van de SAM onder standaardcondities. Verwijder de KPB en spoel tweemaal overvloedig met ultrapuur water en ethanol. De ladingsstroom moet merkbaar zijn afgenomen.

Na de metingen van het onbehandelde goud, wordt het met SAM gemodificeerde gouden substraat blootgesteld aan ongeveer 300 µL van een 5 mM NDT-oplossing in ethanol; laat dit één uur inwerken om de NDT-koppelingsmoleculen te laten interdispergeren binnen de C6-SAM. Verwijder de NDT-oplossing en spoel tweemaal overvloedig en grondig met ethanol en ultrapuur water, gevolgd door één spoeling met diammethaan. Stel het gouden substraat gedurende één uur bloot aan een MPC-oplossing van diammethaan, waarbij agitatie wordt gewaarborgd door langzaam stikstofgas door de vloeistof te borrelen.

Dit is de verankerende MPC-laag van de filmassemblage. Verwijder de MPC-oplossing en spoel opnieuw opeenvolgend met dichloormethaan, ultrapuur water en KPB. Meet de laadstroom van de MPC-laag onder standaardomstandigheden.

Verwijder de KPB en spoel overvloedig met ultrapuur water en DIAM-methaan. Stel het gouden substraat bloot aan ongeveer 300 µL van een 5 mM NDT-oplossing in DIAM-methaan onder agitatie door er gedurende 20 minuten langzaam stikstofgas doorheen te borrelen. Verwijder de NDT en spoel grondig met DIAM-methaan om de tweede MPC-laag af te zetten.

Dompel de filmassemblage opnieuw onder in de MPC-oplossing van DIAM methaan en laat deze gedurende één uur rusten onder agitatie door langzaam stikstofgas door de vloeistof te borrelen, voorafgegaan door spoelbeurten. Meet vervolgens de laadstroom van de MPC-laag opnieuw onder standaardomstandigheden en spoel opnieuw volgens dezelfde procedure. Breng indien gewenst extra MPC-lagen aan.

Nadat de genetwerkte MPC-film is voltooid, spoelt u het gemodificeerde substraat met KPB om AZ-eiwit op de MPC-filmassemblage te laten adsorberen. Injecteer ongeveer 150 µL van een 5 tot 10 µM AZ-oplossing in KPB in de E chem sandwichcel en laat dit met de dop erop ten minste één uur in de koelkast staan. Zodra de ECM-cel weer op kamertemperatuur is, spoelt u deze grondig met KPB, vult u de ECM-cel opnieuw met KPB en belucht u de KPB gedurende 10 minuten met stikstofgas.

Voer elektrochemische monolagenstudies uit, zoals CV, in het potentiaalgebied van -0,25 volt tot 0,25 volt. Scan met 100 millivolt per seconde in KPB Rinse A op een 3M PT MS-gemodificeerde glazen plaat met DIAM methaan en plaats deze gedurende één uur in een MPC-oplossing van DIAM methaan, terwijl deze op lage snelheid op een schudapparaat wordt geschud. Hiermee is de eerste MPC-laag van de filmafzetting voltooid door MPC's te verankeren aan de ME captan-eindgroepen van de sane.

Spoel het objectglas grondig af met dimethylmethaan, droog het met stikstofgas en neem een UV-vis spectrum van het objectglas nadat het objectglas is geweekt in een NDT-oplossing in dimethylmethaan. Plaats het objectglas gedurende één uur in MPC-oplossing terwijl het op een shaker bij lage snelheid wordt geschud. Hiermee is de tweede MPC-laag van de filmassemblage voltooid.

Spoel het objectglas grondig af met DIAM methaan, droog het met stikstofgas en neem een UV-vis spectrum van het objectglas. De absorbentie over het spectrum zou moeten toenemen naarmate er extra MPC-lagen worden geabsorbeerd door de filmassemblage. Om een MPC-film die is geassembleerd op een met 3M PT MS gemodificeerd objectglas te bevestigen aan een standaard microscoopglas.

Bereid de embed eight 12 epoxyhars voor en laat deze gedurende ten minste 12 uur indikken. Vul een beam-capsule met epoxyhars en plaats deze omgekeerd bovenop het MPC-filmmonster. Oefen druk uit op de capsule zodat er een luchtbel naar de bovenkant van de capsule stijgt, waardoor een afdichting tussen de epoxyhars en het MPC-filmmonster ontstaat.

Laat het mengsel ten minste 18 uur polymeriseren bij 60 °C en laat de gemonteerde objectglazen vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Verhit de gemonteerde objectglazen 20 seconden op een gegoten aluminium warmteplaat bij 200 °C om de verwijdering van het blok met de aangehechte MPC op fast film te vergemakkelijken. Zaag het monster met de film van het beam capsule-blok af met een juwelierszaag en plaats het verwijderde deel in een platte siliconen vorm met de MPC-filmzijde naar boven gericht naar het binnenste van de siliconen.

Vul de siliconen holte bij kamertemperatuur met epoxyhars en laat dit ten minste 18 uur polymeriseren bij 60 °C. Laat het monster vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd dunne monstersecties van 60 tot 80 nanometer op een Leica UCT ultramicrotoom met een diamantmes, waarbij de secties loodrecht op de snijkant van het mes worden gesneden. Plaats de gesneden secties op Formvar-koolstofsupportfolie op koperen grids met een maaswijdte van 400 en maak TEM-beelden van de getoonde dwarsdoorsneden van de MPC-filmassemblages.

Hier zijn de resultaten van de monitoring van de dubbellaags oplaadstroom van MPC-filmgroei gedurende in totaal vijf dompelcycli met afwisselende blootstelling aan MPC- en NDT-oplossingen. De oplaadstromen nemen systematisch toe bij elke dompelcyclus. Lagen van MPC worden aan de film toegevoegd.

Hier is een typisch cyclisch voltammogram voor AZ-adsorptie aan een MPC-filmassemblage, verzameld met een potentiaalvenster van -0,25 tot +0,25 V, gescand met 100 mV/s in 4,4 mM kaliumfosfaatbuffer. Een representatieve UV-vis spectraalmonitoring van de groei van een diol-gekoppelde MPC-film op een 3M PT MS-gemodificeerde glazen plaat wordt hier getoond. Een dipcyclus bestaat uit blootstelling van de glazen plaat aan de NDT-linkeroplossing, gevolgd door blootstelling aan de MPC-oplossing.

Elke opeenvolgende dompelbeurt resulteert in een toename van de filmdikte en een gelijktijdige stijging van de absorptie. Deze figuur toont een cross-sectionele analyse via transmissie-elektronenmicroscopie van een DIA-gekoppelde MPC-filmassemblage. De inzet toont een typische TEM-afbeelding van hexa-methol-gefunctionaliseerde MPC's die zijn gebruikt in de TEM-analyse van de filmassemblage.

Met behulp van Image J werd vastgesteld dat de gemiddelde diameter van de gouden kern van de MPC's rond de twee nanometer ligt. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u MPC-gouden nanodeeltjesfilms kunt synthetiseren, karakteriseren en assembleren die fungeren als interface voor de adsorptie en daaropvolgende elektrochemische analyse van redoxeiwitten. Het proces van filmassemblage is eenvoudig aanpasbaar door de syntheseprocedure van de MPC's en het koppelingsmechanisme tussen de deeltjes te manipuleren, om zo de adsorptie van een breed scala aan eiwitten mogelijk te maken.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de elektrochemie van proteïneabsorptie aan gemodificeerde synthetische platforms, kan deze ook worden toegepast bij de ontwikkeling van modellingsystemen voor elektronoverdracht, biosensingschema's en synthetische biocompatibele materialen.