Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van aangelegde elektrische velden op de migratie van neurale progenitorcellen in 2D-culturen en 3D ex vivo-modellen vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst neurale progenitorcellen in vitro te isoleren en te expanderen. De tweede stap is het bereiden van een enkelcel-suspensie van neurale progenitorcellen.

Vervolgens worden, voor de voorbereiding van de 2D-cultuur, neurale progenitorcellen geplaatst in speciaal ontworpen elektrotactische kamers. Alternatief worden, voor de voorbereiding van het 3D ex vivo-model, neurale progenitorcellen gelabeld met hooks 3, 3, 3, 4, 2 en geïnjecteerd in een organotypisch model van een dwarsdoorsnede van het ruggenmerg. Ten slotte wordt er een elektrisch veld aangelegd op de elektrokamers en wordt er een time-lapse-opname gemaakt om aan te tonen dat progenitorcellen in zowel 2D- als 3D-omgevingen migreren naar de kathode van het elektrische veld.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nieuwe methode biedt voor het live volgen van de door elektrische velden geïnduceerde migratie van individuele cellen na transplantatie in een 3D organotypisch model dat sterk lijkt op de natuurlijke omgeving. Deze methode kan niet alleen inzicht verschaffen in de elektrotechniek en de migratie van neurale stamcellen die in ruggenmergplakjes zijn getransplanteerd, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals kleine hersenplakjesmodellen. Om deze procedure te starten, bereidt u glazen stroken van 22 bij 11 millimeter voor door geautoclaveerde vierkanten van 22 bij 22 millimeter te verdelen.

Snijd dekglasplaatjes van dikte nummer één doormidden met een diamantpen. Maak vervolgens een vrijstaande glazen put met binnenafmetingen van 22 bij 10 millimeter door vier verticaal geplaatste glasstrips van 22 bij 11 millimeter aan elkaar te lijmen met hoogvacuüm siliconenvet; laat de put gedurende de nacht volledig drogen en uitharden. Bevestig de volgende dag twee glasstrips van 22 bij 11 millimeter parallel aan elkaar, met een tussenruimte van 10 millimeter, aan de bodem van een kweekschaal van 100 millimeter met behulp van siliconenvet.

Sluit vervolgens het gebied tussen deze strips af door een dekglas van 22 bij 22 millimeter met siliconenvet te bevestigen. Plaats het glazen reservoir op de dekglazen, zodat de binnenwanden een afgesloten ruimte vormen voor het uitplaten van de cellen. Maak alle verbindingen waterdicht met siliconenvet.

Coat dit afgebakende gebied opeenvolgend met poly-D-lysine, gevolgd door laminine zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Verkrijg bij deze procedure de hersenen van muizen in stadium E 14 tot E 16 en plaats deze in koud D-M-E-M-F 12 basaal medium. Verwijder vervolgens de hersenvliezen onder een anatomische microscoop.

Breng daarna de hersenen over naar een Petri-schaal van 35 millimeter. Gebruik de fijne pincet om de hersenen te dissociëren in weefselfragmenten. Breng deze vervolgens over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.

Centrifugeer de monsters op 800 RPM gedurende drie minuten om D-debris te verwijderen. Voeg vervolgens A-D-M-E-M-F 12 met BFDF en DGF toe aan de monsters. Titreer deze met een pipette van één milliliter.

Verkrijg vervolgens de enkelcel-suspensie met behulp van een celzeef. Zaai de cellen uit in de kolfjes tegen een concentratie van 20.000 tot 50.000 cellen per milliliter. Voer vervolgens elke drie dagen een volledige mediumverversing uit, waarbij de cellen gedurende vijf minuten worden gecentrifugeerd bij 1.300 RPM.

Verwijder het supernatant, resuspendeer de PT in vers medium en breng de cellen elke zes dagen terug in de kolf na ten minste vijf keer herhalen. Breng de NEUROSPHERES over naar een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze op 1.500 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant.

Resuspendeer het pellet in tripsen met EDTA om een enkelcellesuspensie te verkrijgen. Bereid vóór het uitvoeren van een cel telling één milliliter suspensie voor die 10 000 cellen bevat. Verwijder vervolgens de laminine uit de glazen put en laat deze volledig drogen.

Vervang dit door één milliliter celсусpensie. Plaats de schaal daarna in de incubator bij 37 °C gedurende minimaal vier uur om hechting mogelijk te maken. Zodra de cellen voldoende confluent zijn, wordt het medium uit de kamer verwijderd.

Verwijder het glas voorzichtig. Vorm vervolgens een dak boven de cellen door een geautoclaveerd dekglas van 22 bij 22 millimeter voorzichtig te bevestigen tussen twee strips van 22 bij 11 millimeter met siliconenvet. Vergeet niet de cellen te bedekken met enkele druppels medium om uitdroging te voorkomen.

Vorm vervolgens aan elk uiteinde van de kamer een geïsoleerd mediumreservoir door twee waterdichte barrières van siliconenvet aan te brengen die van het ene naar het andere uiteinde van de schaal lopen. Vul de kamer met vers medium, waarbij wordt gewaarborgd dat er een doorstroming is van het ene mediumreservoir naar het andere. Plaats de schaal daarna gedurende 12 uur terug in de incubator om herstel van de cellen mogelijk te maken.

Bereid in de volgende stap een deksel voor om de schaal af te dekken door twee gaten te boren, waarbij elk gat boven een reservoir van de migratiekamer is gepositioneerd. Vervang vervolgens het medium in de kamer door kweekmedium dat 25 millimeter hippies buffer bevat. Plaats de schaal daarna in het temperatuurgecontroleerde imagingsysteem.

Stel de experimentele parameters in voor time lapse- en multi-positieopname. Lijn de kamer zo uit dat de kathode en anode respectievelijk links en rechts staan, om te garanderen dat de elektrische veldvector horizontaal loopt zoals gezien onder de microscoop en vastgelegd in het beeldvormingssysteem. Vul vervolgens twee bekerglazen.

Met de Steinberg-oplossing. Verbind een apart bekerglas met elk mediumreservoir met behulp van de vooraf geprepareerde glazen bruggen gevuld met een 2% Steinberg-agaroplossing. Plaats vervolgens de zilverelektroden, die zijn aangesloten op een DC-voeding, in de Steinberg-oplossing.

Zet in elk bekerglas de spanningsregelaar van de voeding op nul en schakel deze in. Meet met een voltmeter de spanning over de elektrotactische kamer terwijl u de spanningsregelaar omhoog draait. Pas vervolgens de spanning aan op basis van de experimentele vereisten.

Start daarna de time-lapse opname. Voer een mediumverversing uit en pas het voltage indien nodig opnieuw aan. Elk uur kunnen naar behoefte vers medium, geneesmiddelen of chemische stoffen aan de reservoirs worden toegevoegd.

Maak extra gaten in het deksel van de kweekschaal, waarbij één gat boven elk mediumreservoir is geplaatst. Dissecteer in deze stap de lumbale ruggenmergen van muizen van twee weken oud. Snijd vervolgens de ruggenmergen met een machel wane weefselhakker onder een anatomische microscoop in secties van 500 micron dik.

Scheid de coupes en selecteer die met een intacte sagittale axiale ruggenmergstructuur. Plaats de coupes vervolgens in een Petrischaal van 100 millimeter die 30 microliters MA-gel bevat. Positioneer ze zo dicht mogelijk bij het centrum.

Bewaar ze in een incubator met 5% carbon dioxide bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Om de matri gel-eiwitten te laten zelf-assembleren, zodat er een dunne film ontstaat die het oppervlak van de dwarsdoorsneden van het ruggenmerg bedekt, is het zeer belangrijk dat de matri gel volledig is geassembleerd. Incubeer de petrischaal indien nodig nog eens 30 minuten bij 37 °C en voeg vervolgens vier tot zes milliliter D-M-E-M-F 12-medium toe dat 25 millimolar heis-buffer en 15 tot 20% foetaal kalfsserum bevat.

Zorg er zeer voorzichtig voor, om te voorkomen dat het medium direct over de plakjes stroomt, dat de plakjes niet volledig ondergedompeld zijn in het medium, zodat het oppervlak van de aubergines goed aan de lucht worden blootgesteld. Ververs het medium tweemaal per week. Incubeer nu de suspensie van neurale progenitorcellen in het medium met vijf micromolar hooks.

3, 3, 3, 4, 2 gedurende 30 minuten. Gebruik onder een microscoop een glazen capillair om twee µL suspensie in de doorsnede van het ruggenmerg te micro-injecteren. Zorg ervoor dat de glazen capillair langzaam door de matrigel gaat en het binnenste van de ruggenmergdoorsnede bereikt.

Houd de glazen buis ten minste 30 seconden in de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg om cel-suspensie te voorkomen. Laat dit inklinken en plaats vervolgens de Petrischaal met de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg overnacht in de incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Bouw de volgende dag een elektrotactische kamer rond de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg met haken 3 3 3 4 2 gelabelde neurogenese-cellen voordat een elektrisch veld van 500 millivolt per millimeter wordt aangelegd.

Hier vertonen de neurale progenitorcellen een sterk gerichte migratie naar de kathode bij blootstelling aan de elektrische velden; de rode lijnen en blauwe pijlen stellen respectievelijk de trajecten en de richting van de celbeweging voor. En hier is de grafiek van de weergegeven migratiepaden. Hier zijn de neurale progenitorcellen gelabeld met hooks 3 3, 3, 4 2.

Deze werden getransplanteerd in de organotypische dwarsdoorsnede van het ruggenmerg aan het begin van de behandeling met het elektrische veld. Nadat de neurale progenitorcellen 2,5 uur lang directioneel naar de kathode waren gemigreerd, werd de polariteit van het elektrische veld omgekeerd. De veranderende polariteit van het elektrische veld veroorzaakte een abrupte omkering van de as richting de nieuwe kathode.

Hier is een afbeelding van de getransplanteerde neurale progenitorcellen binnen de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg. Aan het einde van de time-lapse opname wordt hier een 3D-reconstructie van de getransplanteerde neurale progenitorcellen binnen de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg getoond. Mass mastered.

Deze techniek kan, mits correct uitgevoerd na de ontwikkelingsfase, in twee weken worden voltooid. Deze techniek baant nu de weg voor onderzoekers in het veld van de celbiologie om de migratie van neurale progenitorcellen in 2D- en 3D-culturesystemen te bestuderen als reactie op en toepassing van een elektrisch veld.