Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

Het algemene doel van deze procedure is om micro-regionale weefselhypoxie in de cortex van de muis in vivo direct te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst een open schedelvenster te prepareren bij een geanestheseerde muis. Vervolgens wordt een fluorescerende kleurstof intraveneus geïnjecteerd om de cerebrale bloedvaten te labelen.

Ten slotte wordt gelijktijdig fotonbeeldvorming van de intrinsieke NADH-fluorescentie en de fluorescentie-gemarkeerde corticale microvasculatuur uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die functionele hypoxie in microregio's van het hersenparenchym aantonen door visualisatie van de aanwezigheid van de gereduceerde vorm van nicotinamide-adenine-dinucleotide. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Clark-elektroden, is dat deze een hoge ruimtelijke resolutie biedt over een groot gezichtsveld en bovendien minder invasief is.

Deze methode kan worden uitgevoerd op een standaard toegepast twee-fotonsysteem met twee fluorescentiekanalen. Hallo, ik ben Steve Hurst, professor en hoofd microbiologie en immunologie aan de University of Rochester. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Anita's son uit het Kishka-laboratorium, evenals Oxana Paulka, een research assistant professor uit mijn laboratorium. Dr. Kishka, die de NADH-imagingtechniek pionierde, kan vandaag niet aanwezig zijn omdat hij onlangs naar Duitsland is verhuisd. Nadat de chirurgische plaats is voorbereid met de benodigde instrumenten die zijn geautoclaveerd of gedesinfecteerd met 70% ethanol en de muis is genarceerd met 5% isofluraan, plaatst u deze op een warmtepad en brengt u een gezichtsmasker aan om 1,3 tot 1,5% isofluraan in lucht toe te dienen.

Controleer de diepte van de anesthesie door middel van een knijptest in de staart. Plaats vervolgens een rectale probe en meet continu de lichaamstemperatuur van het dier gedurende de gehele procedure. Breng kunsttranengel aan in de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.

Verwijder vervolgens het haar van de kop en beide dijbenen; breng gedurende twee minuten haarverwijderaar aan op het dijbeen om het resterende haar te verwijderen; het dijbeen zal worden gebruikt voor oximetrie. Desinfecteer tot slot de hoofdhuid met een 10% povidonjodiumoplossing en 70% ethanol. Om een craniële opening te maken, wordt met een schaar vijf millimeter rondom de schedel ingesneden.

Maak een incisie in de hoofdhuid en ga één centimeter verder. Verschuif de huid naar de zijkanten om de schedel bloot te leggen en de membranen op de schedel te verwijderen. Breng een 10% ferricchloride-oplossing aan.

Veeg de overtollige oplossing weg en schraap de membranen weg onder een hoek van 45 graden. Nummer vijf, pincet. Identificeer het gebied van interesse met behulp van een dissectiemicroscoop. Breng een dunne laag snellijm aan rond de randen van het venster van de hoofdplaat.

Positioneer de hoofdplaat zodanig dat het gebied van interesse in het venster zichtbaar is en oefen een lichte druk uit op de hoofdplaat. Breng een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement aan om de lijm snel te polymeriseren. Houd dit 10 seconden vast terwijl de lijm polymeriseert.

Breng een kleine hoeveelheid secondelijm aan op de randen van het venster om de hoofplaat en de schedel af te dichten. Schroef vervolgens de hoofplaat vast aan de dierhouder onder de dissectiescoop. Gebruik hiervoor de micro-torque twee boorset ingesteld op 6.000 RPM en de IRF 0 0 5 boorkop.

Verwijder alle overtollige lijm van de schedel en van de hoofdplaat. Stel vervolgens de boormachine in op 1000 RPM en begin met het boren in de schedel door een cirkel met een diameter van ongeveer 5 mm te maken binnen het venster van de hoofdplaat. Gebruik lichte vegende bewegingen, alsof u met een zeer zacht potlood tekent.

Stop elke 20 tot 30 seconden met boren en gebruik perslucht om het botstof te verwijderen. Naarmate het boren vordert, vormt zich een geul rondom de intacte schedel in het centrum. Let erop dat u niet door de dunne schedel heen boort, maar zorg ervoor dat deze geul overal dezelfde dikte heeft.

Wees daarnaast extra voorzichtig in de buurt van grote bloedvaten. Deze mogen niet worden beschadigd en, indien mogelijk, zelfs niet worden aangeraakt. Til met één punt van een pincet het bot in het centrum van het venster op en breng een druppel kunstmatig cerebrospinaal vocht aan op het venster. Veeg het kunstmatige cerebrospinale vocht voorzichtig weg met de hoek van een Kimwipe in een hoek van 45 graden.

Nummer vijf, pincet. Lokaliseer een beschadigd gebied van de dura langs de rand van het venster en til dit op om het te verwijderen. Indien er bloedingen optreden, breng dan een druppel kunstmatig CSF aan en wacht twee tot drie minuten tot lichte bloedingen zijn gestopt.

Bereid vervolgens 10 milliliter 0,07% laagsmeltende agarose voor, opgelost in kunstmatig cerebrospinaal vocht. Breng de gesmolten agarose op lichaamstemperatuur. Veeg het overtollige kunstmatige cerebrospinaal vocht van het oppervlak van de hersenen.

Giet de aeros in het venster en dek dit af met een dekglas. Druk vervolgens voorzichtig op het glas om contact te maken tussen het glas en de kopplaat en wacht 10 tot 20 seconden tot de aero gestold is. Verwijder met een pincet en zacht weefselpapier de overtollige aero van het dekglas.

Breng een kleine hoeveelheid secondelijm rond het glas aan om het aan de hoofdplaat te lijmen. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement aan om de lijm te verstevigen voor injectie in de femorale vene. Draai het dier gedeeltelijk om om de binnenzijde van het linker dijbeen bloot te leggen.

Gebruik plakband om het dier te fixeren. Breng in deze positie een antiseptische scrub aan en vervolgens honderd procent ethanol op de huid. Maak daarna een incisie langs de mediale dij van de knie tot de pubische symfyse.

Scheid indien nodig de weke delen door middel van botte dissectie. Vul een injectiespuit van één milliliter met 130 µL Texas red. Bevestig een nieuwe naald van 30 gauge en buig deze voorzichtig in een hoek van 30 graden, waarbij de schuin geslepen zijde naar boven blijft wijzen.

Vul de naald onder een dissectiemicroscoop met Texas Red-oplossing, steek de naald in de vena femoralis en injecteer 100 µL Texas Red. Verwijder de naald en druk licht op de vene met gaas om de bloeding te stoppen. Sluit de huid met 4-0 hechtdraad voor continue monitoring van de zuurstofsaturatie in het bloed.

Plaats de oximetersensor op de rechterdij waarvan het haar vooraf is verwijderd. Om te beginnen met de beeldvorming, brengt u de chirurgisch geprepareerde muis over naar de microscooptafel. Maak een eerste foto van de locatie van het craniële venster met Bright Field-verlichting bij een viervoudige vergroting om als referentiekaart te gebruiken voor registratie met een hogere vergroting voor foton-anisotropie.

Zoom in op het gebied van belang met een 10x vergroting. Selecteer een gebied van belang in de corticale lagen. Druk op één of twee om de tijdserie op te nemen.

We raden aan om een gemiddelde van drie tot vijf frames te gebruiken om de beeldkwaliteit te verhogen. Wek vervolgens hypoxemie op door 50% stikstof toe te voegen aan de lucht die het dier inademt. Dit zal het zuurstofgehalte naar 10% brengen. Verifieer de hypoxemie door de gegevens van de oximeter te bewaken.

Ga door met het registreren van de tijdreeks tijdens de hypoxemie gedurende ongeveer 30 seconden en nadat het normale zuurstofgehalte is hersteld. Verzamel gegevens voor de berekening van de zuurstofdistributie door het gebied van hypoxie en de zuurstofrijke weefselcilinders rond de bloedvaten te detecteren, te meten en te kwantificeren. Om de straal R van de weefselcilinder te bepalen, meet u de afstand tussen het centrum van het bloedvat en de grens waarbij een hoge NADH-fluorescentie wordt gedetecteerd.

Raadpleeg het geschreven protocol voor de methoden van gegevensverwerking. Deze figuur toont gelijktijdige NADH- en geografische beelden uit een video-opname tijdens transiënte hypoxemie, waarbij de geïnhaleerde zuurstofconcentratie gedurende een periode van drie minuten werd verlaagd van 21% naar 10%. Dit niveau van experimenteel geïnduceerde hypoxemie is voldoende om ernstige hypoxie in de cerebrale cortex op te wekken.

Hypoxie leidde tot een toename van de NADH-fluorescentie, aanvankelijk in groen weergegeven in de gebieden die het verst van de arteriële bloedtoevoer afliggen. Let op de scherpe NADH-weefselgrenzen, die de waarneembare weefselgrenzen van zuurstofdiffusie vanuit de corticale microcirculatie vertegenwoordigen, weergegeven in rood. Hier is een gelijktijdige afbeelding van de fluorescentielabelled microvaten van de cortex in rood, en de intrinsieke NADH-fluorescentie van de grijze stof van de cortex in groen; de distributie van de NADH-fluorescentie-intensiteit is binair.

Er zijn gebieden met uniform lage NADH-fluorescentie en gebieden met uniform hoge NADH-fluorescentie. De gele lijnen stellen de weefselgrenzen voor tussen de gebieden met lage en hoge NADH-fluorescentie. Deze weefselgrenzen vertonen een ruimtelijke relatie met de nabijgelegen microvaten.

Deze relatie wordt bepaald door de zuurstofdiffusie vanuit de microvaten naar het weefsel. In sommige gevallen kan de cilindrische aard of de CRO-weefselcilinder van deze weefselgrenzen direct worden herkend, zoals aangegeven door de blauwe lijnen. Hier heeft de weefselgrens een cirkelvorm met een concentrisch centraal bloedvat zodra deze beheerst is.

Deze techniek kan in 1,5 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden het dekglas op de metalen plaat te lijmen om verticale beweging van het corticale oppervlak als gevolg van oedeem te voorkomen. Na deze procedure kunnen aanvullende analyses worden uitgevoerd, zoals metingen van functionele hyperemie, met als doel aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de relatie tussen weefselhypoxie en cerebrovasculaire koppeling.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u micro-regionale weefselhypoxie in de cortex van muizen kunt visualiseren.