Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks

Het algemene doel van deze video is om te demonstreren hoe netwerkactiviteit in ontwikkelende corticale hersensecties kan worden gemeten met behulp van een calciumgevoelige fluorescerende indicator. DY-hersensecties worden gemaakt van de ontwikkelende enterale cortex van een jonge muis. Zowel neuronen als astrocyten worden geladen met calciumafhankelijke markers.

Veranderingen in de fluorescentie van calciumafhankelijke kleurstoffen weerspiegelen veranderingen in de cellulaire activiteit. Niet-neurale cellen, waaronder astrocyten, microglia en endotheelcellen, kunnen worden gekleurd met specifieke markerkleurstoffen. Corticale netwerkactiviteit wordt geregistreerd met time-lapse multiphoton-beeldvorming; cellen binnen het netwerk worden gedetecteerd door een 3D-stack van beelden te maken van het onderzoeksgebied.

Veranderingen in de cellulaire fluorescentie over meerdere cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd om de activiteit van het ontwikkelende corticale netwerk af te lezen. Een kenmerkend activiteitspatroon in het ontwikkelende zenuwstelsel is spontane gesynchroniseerde netwerkactiviteit. Gesynchroniseerde activiteit is waargenomen in veel verschillende ontwikkelende neuronale regio's, waaronder intact ruggenmerg, cortex en gedissocieerde neuronale cultuurpreparaten tijdens perioden van spontane activiteit, waarbij neuronen depolariseren om enkele spikes of bursts van actiepotentialen te vuren, die veel ionkanalen activeren, waaronder spanningsafhankelijke calciumkanalen, wat leidt tot calciuminstroom.

Hoog gesynchroniseerde activiteit is gemeten in lokale netwerken met behulp van veldelektroden of multi-elektrode-arrays. Deze maken hoge temporele bemonsteringssnelheden mogelijk, maar bieden een lagere ruimtelijke resolutie vanwege de geïntegreerde uitlezing van de celactiviteit. Resolutie op enkelvoudige celniveau van neurale activiteit is mogelijk door middel van patchclamp-elektrofysiologie van individuele neuronen om vuursnelheden te meten.

De mogelijkheid om metingen in een netwerk uit te voeren is echter beperkt tot het aantal neuronen dat gelijktijdig gepatcht kan worden, wat gewoonlijk slechts één of twee neuronen zijn. Het gebruik van calciumafhankelijke fluorescente indicatorstoffen heeft het mogelijk gemaakt om gesynchroniseerde activiteit in een netwerk van cellen te meten. Deze techniek biedt zowel een hoge ruimtelijke resolutie als voldoende temporele bemonstering om de spontane activiteit van het ontwikkelende netwerk te registreren.

Fluorescente calciumgevoelige indicatoren, zoals URA 2:00 AM-ester, bevatten carbonzuurgroepen die in staat zijn calciumionen te binden. Deze fluorescerende kleurstoffen worden geactiveerd door specifieke golflengten van licht, gebruikmakend van een-fotonen- of twee-fotonenmicroscopie. Het aantal fotonen dat door de kleurstof wordt uitgezonden, verandert tijdelijk bij binding van calcium.

Deze verandering in het aantal fotonen of de fluorescentie wordt gerapporteerd als het delta FF-signaal en komt overeen met een verandering in het calciumgehalte binnen het neuron. De meting van veranderingen in calciumgevoelige indicatoren is een nuttige uitleesmaat voor netwerkactiviteitspatronen in ontwikkelende cellen. Hallo, ik ben Rianna Morty, en mijn naam is Julie Abbots.

Wij zijn verbonden aan de Afdeling Interpretatieve Neurofysiologie van de universiteit in Amsterdam. We hebben calcium-imaging gebruikt om de functionele activiteit in ontwikkelend weefsel in de cortex van de muis te bestuderen, waarbij gebruik is gemaakt van calciumgevoelige indicatoren bij multifocale imaging. Het doel van deze korte film is om te demonstreren hoe deze methoden kunnen worden ingezet om zowel spontane als opgewekte activiteitspatronen in ontwikkelende netwerken in het zenuwstelsel te meten.

Verwijder de hersenen snel uit de schedel van een jonge muis om schade aan de neurale circuits te beperken. Disseceer de hersenen in ijskoude snijoplossing. De snijoplossing bevat cholinechloride in plaats van het natrium dat gewoonlijk in A TSF wordt gebruikt voor neuronale registraties.

In deze experimenten maken we hersensecties van de enterele cortex van de ontwikkelende muizenhersenen. Plaats een stuk filterpapier op een petrischaal en bevochtig dit met enkele milliliters A TSF. Breng de hersenen over naar het stuk filterpapier.

Hals de hemisferen door met een enkelbladig scheermesje. Scheid de twee hemisferen. Plaats er één terug in de ijskoude snijoplossing samen met de overgebleven hemisfeer.

Verwijder het cerebellum met het scheermesje. Kantel één hemisfeer op de middellijn en maak een snede van ongeveer one millimeter vanaf het dorsale oppervlak, waarbij het mesje in een lichte hoek naar het rostrale uiteinde is gericht. Draai de hersenen om naar.

Reinig het recent gesneden oppervlak met een wattenstaafje en een metalen spatel. Verplaats de hersenen naar het metalen snijblok. Duw de hersenen voorzichtig met een wattenstaafje van de spatel af op het gelijmde oppervlak.

Er worden hersensecties van 300 Micrometer gesneden; voor jong weefsel zijn de snijsnelheden en de bladfrequentie doorgaans lager dan die voor volwassener weefsel. Breng na het snijden elke sectie over met een glazen pipet naar de bewaarkamer, die zuurstofrijk A TSF op kamertemperatuur bevat. De A CSF bevat een hogere verhouding magnesium ten opzichte van calcium dan de A CSF-oplossing.

De voor opname gebruikte coupes worden één uur gelaten om te herstellen. Om de cellen te laden met een calciumafhankelijke indicator of een celspecifieke marker, moeten de coupes worden overgebracht naar een kamer voor de kleuringsprocedure. Hoewel er commerciële kamers beschikbaar zijn, kan er eenvoudig een worden samengesteld uit standaard laboratoriummateriaal tegen zeer lage kosten.

Om een kleuringskamer te maken, heeft u de volgende basis laboratoriumuitrusting nodig: twee plastic petrischalen, één spuit van 10 milliliter, een stuk siliciumbuis, een celkweekinsert met een semipermeabel membraan, secondelijm, drie kleine buiskoppelingen en een fijne naald. Neem de grote petrischaal en maak met een verhitte staaf een klein gaatje door de zijwand. Neem de kleine petrischaal en maak een gat met een vergelijkbare diameter dat groot genoeg is om de siliciumbuis doorheen te laten gaan.

Haal een stuk siliconen slang door het gat en vorm een lus in het kleine schaaltje. Gebruik secondelijm om het open uiteinde van de slang af te dichten. Plak vervolgens het resterende deel van de slang aan de binnenwand van de kleine petrischaal.

Plaats de kleine petrischaal in het midden van de grote schaal en lijm deze vast. Neem het overgebleven uiteinde van de siliconen slang en steek dit door het kleine gat in de zijwand van de petrischaal. Gebruik een fijne naald om kleine gaatjes in de siliconen slang aan de binnenzijde van de petrischaal te maken.

Maak de gaatjes met gelijke tussenpozen voor een gelijkmatige gasfusie. Gebruik een verhit scalpel bij een celkweekputje met een semipermeabel membraan. Snijd de bovenste één centimeter van het putje weg, zodat er een ondiep schaaltje overblijft om de plakjes tijdens de incubatie vast te houden.

Plaats de ondiepe schaal in het midden van de kleine schaal, omringd door de poreuze siliconen buisjes. Maak een gat van ongeveer een halve tot één centimeter diameter in het deksel van de grote schaal. Neem een plastic spuit van 10 milliliter met behulp van een verhit scalpel.

Maak een schuine snede om het uiteinde van de spuit te verwijderen. Breng secondelijm aan op het gesneden oppervlak van de spuitbuis. Plak dit direct over het gat in het deksel van de grote Petrischaal.

Bevestig een slangconnector aan het uiteinde van de spuitpunt. Plaats de ondiepe schaal in het midden van de kleine Petrischaal, waarbij wordt gewaarborgd dat de poreuze gasleiding rondom de schaal ligt. Deze leiding wordt vervolgens aangesloten op een carbogeentoevoer om de coupes te oxygeneren.

Vervang tijdens de incubatie het deksel van de grote schaal, die via de spuitpunt ook rechtstreeks is aangesloten op de gastoevoer. Dit zorgt voor een toevoer van koolstofdioxidegas over de coupes tijdens de incubatie om bleken van de kleurstof te voorkomen. Alle procedures worden met zo min mogelijk licht uitgevoerd, en zowel de kleurstof als de coupes worden in het donker bewaard.

Vul de kleurkamer met ongeveer anderhalf milliliter A TSF vanuit de slicehouder. Plaats de interfacekamer erin en vul deze met nog een milliliter A TSF. Het is belangrijk om een goede zuurstofvoorziening te handhaven om het weefsel gezond te houden en voor een goede belading van de slice.

De kleuring vindt plaats bij ongeveer 35 °C om de opname van de kleurstof in de neuronen te vergemakkelijken terwijl de kleurkamer opwarmt. Bereid de indicator kleurstof voor fira 2:00 AM Ester voor. Voeg 9 µL DMSO met 1 µL onizuur toe aan een flacon van 50 µg.

DMSO en oniczuur. Deze fungeren als permeabilisatie-middelen om de opname van de kleurstof door het lipide membraan mogelijk te maken. Vortex het flacon gedurende 15 minuten om te garanderen dat de kleurstof volledig is opgelost.

Breng voor de kleuring elke plak over naar de interface. Plaats deze in de kleurkamer. Breng de kleurstof direct aan op het interessegebied boven de plakken en sluit het deksel van de kleurkamer.

Laat de coupes 20 tot 40 minuten in het donker incuberen, afhankelijk van de leeftijd van de gebruikte muis. Breng de coupes na incubatie terug in de houder om eventuele resterende overtollige kleurstof af te wassen. De kleuringsprotocollen voor calcium-imaging kunnen ook worden aangepast voor ouder weefsel.

Hiervoor is een extra stap van pre-incubatie vereist. Breng de oude coupes over naar een ondiepe pre-incubatieschaal gevuld met 3 mL CSF en 8 µL crema four-oplossing op 0,5%. Verwarm dit gedurende drie minuten tot 35 °C. Breng de coupes vervolgens over naar de interface, plaats ze in de kleurkamer en volg de normale kleurprocedures.

Het is ook mogelijk om deze coupes te kleuren voor niet-neuronaal cellen, namelijk astrocyten, microglia en endotheelcellen. Sulfur rumine 1 0 1 kan worden gebruikt om astrocyten te kleuren voor sulfur domine. Maak een oplossing van 10 micromolar en pipetteer de paarse kleurstof over het interessegebied in de coupes.

Laat dit 15 minuten incuberen. Breng de coupes terug naar de bewaardeskamer om overtollige kleurstof te verwijderen. Het FSE-conjugaat van tomatenlectine kan worden gebruikt voor het kleuren van microglia en endotheelcellen.

Maak voor tomatenlectine een oplossing van 20 µg/mL. Breng de kleurstof aan over het interessegebied in de coupes. Laat de coupes gedurende 45 minuten incuberen.

Breng de coupes vervolgens nogmaals over naar de bewaarkamer. Tijdens de beeldvorming moeten de coupes stabiel onder de microscoop liggen. Meestal wordt een metalen harp geplaatst om het weefsel plat te houden, maar dit kan het oppervlak van de coupe ongelijkmatig vervormen, waardoor slechts een beperkt gezichtsveld in focus is voor de beeldvorming, wat vermeden moet worden.

Deze coupes worden aan de registratiekamer gehecht met behulp van een polyethyleen- of PEI-oplossing. PEI is een polymeer dat wordt gebruikt om de hechting van cellen aan een oppervlak gedurende ten minste één uur te verbeteren. Vul de registratiekamers met enkele milliliters PEI-oplossing om de bodem van de kamer te bedekken voordat de coupes in de registratiekamers worden geplaatst.

Spoel eerst de PEI uit de kamer met gedestilleerd water, gevolgd door een CSF-oplossing. Breng een slice over naar de registratiekamer en verwijder het overtollige CSF-oplossing. Positioneer de slice in het midden van de kamer met behulp van een fijn penseel.

Verwijder alle overgebleven A CSF met kleine stukjes absorberend filterpapier. Zorg ervoor dat er geen A CSF meer rond de randen van het slice aanwezig is. Breng tot slot voorzichtig een halve milliliter A CSF aan op het slice zonder het los te maken uit de kamer.

Plaats de kamers in een grote, zuurstofrijke interface-container en laat deze nog een uur in het donker staan. Veranderingen in calciumgevoelige indicatorstoffen kunnen worden geregistreerd met één- of tweefotonmicroscopie. Wij gebruiken een titanium-saffierlaser gekoppeld aan een Olympus-microscoop om tweefotonimaging in onze neuronale netwerken mogelijk te maken.

Daarnaast maken wij gebruik van een L Vision biotech trim scope-systeem met een EM CCD hammer MATSU-camera voor verhoogde frame-scan-snelheden. Plaats de slice-kamer onder de microscoop met een stabiele stroom gezuurstofte A-T-S-F-A-T-S-F dat 1.6 millimolar calcium en 1.5 millimolar magnesium bevat; in de opstelling wordt dit met wit licht verwarmd tot ongeveer 30 °C.

Lokaliseer het interessegebied in de coupes en stel scherp op het oppervlak. Schakel de verlichting uit en sluit de deur van de registratiekast om het achtergrondlicht te verminderen.

Er zijn veel verschillende commerciële of open-source softwarepakketten beschikbaar voor het vastleggen en analyseren van beelden. In ons laboratorium gebruiken we de software Inspector van Lavis Biotech voor de acquisitie. Selecteer voor het starten van de beeldvorming de CCD-cameramodus voor detectie. Stel de golflengte in die relevant is voor uw indicator.

Voor fira 2:00 AM Ester stellen we de excitatie in op 820 nanometer in de trim scope-software. Selecteer de 64 B scanmodus. Kies de optimale gezichtsveldgrootte en pixelresolutie voor het betreffende interessegebied.

Selecteer een geschikte framerate en pixelspinning indien vereist voor uw beeldsteekproefname. Open de lasersluiter ter voorbereiding op continue beeldvorming. Gebruik de modus voor continue beeldvorming.

Pas de versterking en laserintensiteit aan en focus op het neurale netwerk dat u wilt afbeelden. Stop het scannen. Selecteer de time-lapse-instellingen voor de beeldsnelheid en de duur van de sequentie.

Maak na de time-lapse imaging een Z-stack van beelden met stappen van 1 micron, 20 microns boven en 20 microns onder het focusvlak. Deze Z-stack wordt gebruikt voor celdetectie tijdens de analyse. Exporteer de opgenomen bestanden als een stack van TIFF-afbeeldingen.

Ter afsluiting hebben we het gebruik van calciumindicatoren gedemonstreerd om synchrone spontane netwerkactiviteit in de ontwikkelende cortex te meten. Meer details over de methodologie en reagentia zijn te vinden in de databladen die bij deze film horen, zodat u de techniek in uw eigen laboratorium kunt implementeren.