Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse
22 februari 2012
In dit rapport beschrijven we een methode om de muis heupzenuw te verpletteren. Deze methode maakt gebruik van direct beschikbaar hemostatische tang en gemakkelijk en reproduceerbaar maakt complete heupzenuw crush. Daarnaast beschrijven we een methode om de spieren hele mounts geschikt voor analyse van de zenuw regeneratie na heupzenuw verliefd te bereiden.
Het hoofddoel van deze procedure is om een eenvoudige, reproduceerbare methode voor het verbrijzelen van de nervus ischiadicus en de whole-mount analyse van spierreïnnervatie na het verbrijzelen van de nervus ischiadicus te demonstreren. Dit wordt bereikt door eerst de nervus ischiadicus bloot te leggen, waarbij chirurgische retractors correct worden geplaatst om een goede toegang tot de zenuw te garanderen. Vervolgens wordt de zenuw verbrijzeld met hemostatische klemmen en gemarkeerd met houtskool.
Verwijder vervolgens de individuele spieren die door de nervus ischiadicus worden geïnnerveerd uit het achterpoot. De laatste stap is het dissekeren van individuele spieren voor whole mount-analyse na immunokleuring. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat een reproduceerbare compressie van de nervus ischiadicus eenvoudig kan worden uitgevoerd en dat muscle hole mounts kunnen worden gebruikt om de daaropvolgende regeneratie te analyseren.
Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat het een eenvoudige, reproduceerbare techniek biedt om de nervus ischiadicus te verbrijzelen en vervolgens de axonale regeneratie te scoren. Begin deze procedure door de muis voor de chirurgie te anesthetiseren met een cocktail van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine via intraperitonele injectie om postoperatieve pijn te minimaliseren. De muis krijgt daarnaast een subcutane injectie van 10 mg/kg meloxicam.
Scheer vervolgens beide achterkwartieren zorgvuldig met een chirurgische trimmer. Breng daarna ontharingscrème aan voor volledige verwijdering van de haren. Reinig de huid met een steriele wattenstaaf en Betadine chirurgische scrub.
Breng daarna met een steriele wattenstaafje oogzalf aan in de ogen. Plaats de muis op een schone roestvrijstalen plaat op een voorverwarmde homeothermische warmtekleed en houd de temperatuur van het dier op 37 °C. Plak vervolgens alle ledematen vast.
Positioneer het achterste ledemaat zorgvuldig symmetrisch, zodat het kniegewricht een rechte hoek vormt met het lichaam. Dek vervolgens het operatieveld onder de microscoop af met een steriel doek. Maak een halvcirkelvormige incisie over de middenlijn.
Scheid de huid voorzichtig van de onderliggende musculatuur en vouw deze af en toe terug. Breng ongeveer 0,1 milliliter steriele zoutoplossing aan om de operatielocatie gedurende de procedure vochtig te houden. Open vervolgens het fasciaire vlak tussen de musculus gluteus maximus en de anterieure kop van de musculus biceps femoris.
Om de nervus ischiadicus bloot te leggen voor een chirurgische controle. De contralaterale nervus ischiadicus moet worden blootgelegd en gemobiliseerd, maar intact worden gelaten. Plaats vervolgens de gluteale musculatuur terug en hecht deze.
Leg de experimentele nervus ischiadicus op dezelfde wijze vrij met behulp van retractors. Voor een betere visualisatie wordt de nervus ischiadicus voorzichtig uit het omliggende bindweefsel bevrijd met een iridectomieschaar.
Gebruik vervolgens de fijne 5 45 pincet om de zenuw in de onderste kaken van de super fijne hemostatische klem te plaatsen; richt de drie fascikels naast elkaar uit, niet bovenop elkaar. De hemostatische klem is voorzien van een markering op 1,5 millimeter vanaf de punt. Plaats het buitenste gedeelte van de nervus ischiadicus in lijn met deze markering voordat deze wordt verbrijzeld.
Dit garandeert een verbrijzeling van uniforme breedte en voorkomt dat de zenuw buiten de klemmen van de hemostatische tang uitsteekt wanneer deze door de verbrijzelingskracht wordt platgedrukt. Als de zenuw buiten de punten van de tang uitsteekt, zal de zenuw slechts gedeeltelijk worden verbrijzeld. Gebruik een tweede paar hemostatische tangen dat vooraf in koolstofpoeder is gedoopt om de verbrijzelingsplaats te markeren.
Verbrijzel de zenuw op dezelfde verbrijzelingsplaats gedurende 15 seconden bij drie klikken. Er mag geen koolstofmarkering buiten de grens van de initiële verbrijzeling uitsteken. Dit is bijzonder belangrijk als een nauwkeurige markering van de verbrijzelingsplaats vereist is; dip de pincet vooraf in koolstof om wijdverspreide koolstof op de chirurgische plaats te voorkomen.
Open de pincet in gepoederde koolstof. Sluit deze vervolgens voorzichtig. Gebruik steriel gaas om de koolstof aan de buitenkant van de hemostaten af te vegen.
Controleer de pincet onder een vergroting van ten minste drie keer om te verifiëren dat de verbrijzelende oppervlakken gelijkmatig zijn bedekt met poederkoolstof. Indien nodig worden ze opnieuw in het poeder gedoopt en afgeveegd; herplaats en hecht de gluteale musculatuur op dezelfde manier als aan de contralaterale zijde. Sluit tenslotte de huidincisie met de negen millimeter reflexclips.
Indien blijkt dat reflexclips van negen millimeter de beweging beperken, kunnen kleinere reflexclips of zes aut-hechtingen worden gebruikt. Verwijder in plaats daarvan, na het offeren van de muis, voorzichtig vier spieren uit het achterste ledemaat: de tibialis anterior, extensor digitorum longus, peroneus longus en de soleus, door ze via hun bindweefsel vast te pinnen op een met zwarte wax beklede schaal.
Spoel ze vervolgens met PBS. Fixeer ze daarna gedurende 30 minuten in 4% paraformaldehyde. Om elke spier op een met zwart zand gecoate Petrischaal te dissekeren, verwijdert u de pezen met de iridectomieschaar.
Maak de spieren vervolgens dunner door de binnenste spiervezels weg te pellen. Behoud zorgvuldig het buitenoppervlak van de spier, inclusief de eindplaatbanden. Monteer de resulterende spieren vervolgens op plus-objectglazen met Vector Shield en 22 bij 40 millimeter glazen dekglasplaatjes en seal twee zijden met transparante nagellak. Wanneer ze correct op het objectglas zijn gemonteerd, moeten de eindplaatbanden in contact staan met de dekglasplaatjes.
Hier is een voorbeeld van een verbrijzelingsplaats in situ bij het linker achterbeen. De verbrijzelingsplaats is aangegeven met zwarte koolstof. Het asteriskteken markeert een tak van de nervus tibialis die de dijspieren innerveert en dient als een nuttig oriëntatiepunt.
Tijdens de crush-operatie is de tibiale tak van de nervus ischiadicus in blauw omlijnd, de peroneale tak in groen en de srel in geel. Deze semi-dunne sectie toont een volledige verbrijzeling uitgevoerd met hemostatische forceps. Pijltjes geven hier de verbrijzelde vezels aan.
Een onvolledige verbrijzeling, uitgevoerd met de schuine pincet, is zichtbaar in een andere semi-dunne sectie. Pijlpunten geven opnieuw verbrijzelde vezels aan, terwijl pijlen behouden axonen aangeven. Dit zijn de gerenderde beelden van de gehele spierpreparaten.
Na verwijdering van het bindweefsel en daaropvolgende uitdunning, worden de nplate-banden op elke spier omlijnd. Hier wordt de volledige mount van de m. gastrocnemius soleus getoond. 14 dagen na verbrijzeling van de nervus ischiadicus.
De pijlen geven gebieden van de neuromusculaire overgang aan die opnieuw zijn geïnnerveerd door een axon. Hier is de demonstratie van een gedennerveerde neuromusculaire overgang. De Gap43-positieve Schwannceluitlopers worden aangegeven door de pijlpuntjes.
Er zijn geen axonen zichtbaar in deze gedenerveerde neuromusculaire overgang. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u op reproduceerbare wijze een statische zenuw kunt pletten en spierhormoonpreparaten kunt maken voor de analyse van regeneratie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit verslag beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het pletten van de nervus ischiadicus van de muis en het analyseren van de spierreïnnervatie. De techniek maakt gebruik van algemeen beschikbare hemostatische klemmen om een volledige zenuwpletting te bewerkstelligen en omvat de preparatie van volledige spier-mounts voor regeneratieanalyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve geneeskunde
- Spiersfysiologie
Achtergrond
- Letsels aan de nervus ischiadicus kunnen leiden tot aanzienlijke motorische tekorten.
- Inzicht in zenuwregeneratie is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- Whole mount-analyse biedt inzicht in spierreïnnervatie.
- Bestaande methoden kunnen tekortschieten in reproduceerbaarheid en toegankelijkheid.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode voor het verbrijzelen van de nervus ischiadicus te demonstreren.
- Om volledige preparaten van spierweefsel voor te bereiden voor de daaropvolgende analyse van zenuwregeneratie.
- Om een eenvoudig protocol te bieden dat gemakkelijk door onderzoekers kan worden overgenomen.
Gebruikte methoden
- Leg de nervus ischiadicus vrij met behulp van chirurgische retractoren.
- Plet de zenuw met hemostatische klemmen en markeer deze met houtskool.
- Verwijder individuele spieren die door de nervus ischiadicus worden geïnnerveerd uit het achterste ledemaat.
- Dissekeer de spieren voor whole mount-analyse na immunovleuring.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een consistente en volledige verbrijzeling van de nervus ischiadicus mogelijk.
- Whole-mount preparaten van spieren kunnen effectief worden geanalyseerd op regeneratie.
- De resultaten tonen de haalbaarheid van deze aanpak aan voor het bestuderen van zenutherstel.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van processen van spierreïnnervatie.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbaar instrument voor onderzoekers die zenuwletsels bestuderen.
- Whole mount-analyse is een waardevolle techniek voor het beoordelen van spierreinnervatie.
- Het protocol kan eenvoudig worden geïmplementeerd in verschillende onderzoeksomgevingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode biedt een reproduceerbaar model voor het bestuderen van perifere zenuwregeneratie, waardoor mechanistische risicoreductie van therapeutische targets in preklinische neurowetenschappelijke programma's mogelijk wordt gemaakt. Door de compressie van de nervus ischiadicus te standaardiseren en reïnnervatie te kwantificeren via whole-mount spieranalyse, ondersteunt het de validatie van targets en de ontwikkeling van assays voor neuroprotectieve of neuroregeneratieve kandidaten. De benadering vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door axonale groei te koppelen aan functionele read-outs van reïnnervatie.
Strategische toepassingen in biofarma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over axonale regeneratie en interacties van Schwann-cellen te onderzoeken in een genetisch hanteerbaar model.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van algemeen beschikbare transgene muislijnen om moleculaire mechanismen van zenutherstel te ontleden met een hoge reproduceerbaarheid.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, voor imaging geschikte resultaten (bijv. reïnnervatie van de neuromusculaire overgang) voor high-content screening van verbindingenbibliotheken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de markering van de verbrijzelingsplaats en de spierpreparatie om de consistentie van de assay tussen laboratoria en tijdspunten te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door axonotmesis te modelleren, een klinisch relevante perifere zenuwbeschadiging.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via longitudinale correlatie tussen structuur en functie van de regeneratie.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen en biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van biologische geneesmiddelen of kleine moleculen die gericht zijn op het verbeteren van zenuwherstel.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en functionele targetvalidatie door nauwkeurige meting van de kinetiek van axonale regeneratie mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare weefselpreparaten met kwantificeerbare afhankelijke variabelen (bijv. re-innerverende eindplaatbanden) voor de beoordeling van het effect van verbindingen.
- Analytics: Genereert statistische output uit whole-mount imaging waarmee de regeneratie-efficiëntie tussen verschillende experimentele condities kan worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de preklinische continuïteit door gebruik te maken van een knaagdiermodel dat predictief is voor menselijke reacties op perifere zenuwletsels.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar platform voor herhaald gebruik bij target de-risking en lead-optimalisatiecampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie door directe visualisatie van interacties tussen axonen, Schwanncellen en de basale lamina.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde verbrijzelingskracht, site-markering en een protocol voor whole mount van spierweefsel.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de pijplijn objectieve, op histologie gebaseerde regeneratiemetrieken te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroregeneratieve kandidaten mogelijk op basis van functionele reïnnervatiegegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, weefseldissectie en immunofluorescentiekleuring.
- Is afhankelijk van toegang tot stereomicroscopen, hemostatische pincetten en beeldsystemen voor whole mount-analyse.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams wat betreft de duur van het verbrijzelen, de markeringstechniek en de timing van de spierfixatie.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van het model op verschillende muizenstammen of genetische achtergronden.
- Beperkt door de noodzaak van terminale procedures en deskundige hantering om de consistentie van het verbrijzelen en de nauwkeurigheid van de markering te behouden.
