Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Dit protocol is geoptimaliseerd voor het inkapselen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen en het differentiëren daarvan tot dopaminerge neuronen in een 3D-systeem. Behandel eerst de kolonies met een ROCK-inhibitor (RI) en dissocieer ze tot enkelcellen; meng deze met natriumalginaat en leid ze door het inkapselingsapparaat. Zet de RI-behandeling drie dagen voort, breng de ingekapselde cellen over naar PA6-cellen en differentieer deze gedurende 28 dagen.

Uiteindelijk tonen analyses van gen- en eiwitexpressie een hogere efficiëntie aan bij het genereren van dopaminerge neuronen. Het belangrijkste voordeel van deze specifieke techniek ten opzichte van het bestaande 2D-differentiatieprotocol is dat we proberen deze cellen te propageren en te differentiëren in een 3D-omgeving, en dat deze 3D-omgeving de mogelijkheid biedt om cellen met een hoge dichtheid te propageren. Daarnaast biedt dit de kans op een betere cel-celinteractie voor differentiatie.

En ten derde zorgt het u verderop in het proces voor een betere differentiatie-efficiëntie. Daarnaast zou ik willen toevoegen dat deze specifieke techniek ook kan worden aangepast voor andere typen cellen die we in een 3D-omgeving kunnen kweken. Onthoud nu ook dat, zoals bijvoorbeeld in dit geval, deze specifieke techniek is geoptimaliseerd op basis van het gebruik van een specifieke rock-inhibitor die celapoptose voorkomt en ook voorkomt dat de cellen loslaten van de kweekschalen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode in het begin moeite hebben, aangezien deze techniek doorgaans niet wordt toegepast in weefselkweek. De volgende inkapselingstechniek is geoptimaliseerd op basis van de samenvattende studies van Dr. Dean en Dr. Chad over de toepassing van het R-inhibitortype alginaat, de alginaatconcentratie en de instellingen van het inkapselingsapparaat. Jamie en Kim, een PhD-student uit ons laboratorium, zullen nu dit protocol demonstreren.

Voeg 25 milliliter steriele 0,1% gelatineloplossing toe aan 275 milligram gezuiverd natriumalginaat in een steriele buis van 50 milliliter en vortex deze om het alginaatpoeder gedeeltelijk op te lossen. Plaats de buis vervolgens gedurende de nacht op een orbitale mengmachine bij 10 keer G. Voeg daarna 9% steriel natriumchloride toe aan de alginaatoplossing.

Vortex gedurende 30 seconden en centrifugeer vervolgens bij 95 ×g gedurende vijf minuten. Bewaar de alginaatoplossing bij vier °C. Behandel de humane embryonale stamcellen eerst in een donkere omgeving voor met kweekmedium aangevuld met 10 µM ROCK-inhibitor.

Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. Was de cellen nu tweemaal met DPBS om de cellen enzymatisch los te maken. Voeg accutane toe en incubeer gedurende 10 minuten.

Oogst de cellen voorzichtig met een celscraper bij 37 °C en breng deze over naar een buis van 15 milliliter. Neutraliseer het Accutane met een gelijk volume SL-medium. Leid de geneutraliseerde cellen vervolgens door een filter van 40 micron in een schone centrifugebuis van 50 milliliter.

Gebruik nu een hemocytometer om de cellen te tellen. Pelleteer de cellen door middel van centrifugatie en verwijder voorzichtig het supernatant. Was de cellen vervolgens één keer met voorverwarmde buffer.

0,9% natriumchloride. Centrifugeer het pellet en verwijder het supernatant. Om de menselijke embryonale stamcellen te inkapselen, begint u met het resuspenderen van de cellen in voorverwarmde alginaatoplossing.

Om dit te doen, bevestigt u een spuit van 20 milliliter aan een zachte plastic slang en zuigt u alginaat op in de spuit. Meng vervolgens de celсусpensie voorzichtig met de spuit zonder bellen te vormen. Zuig nu de cellen op in de spuit.

Gooi de plastic slang weg en bevestig vervolgens de spuit aan de inkapselingsmachine. Ga over tot de installatie van de instrumenten: de bead-generator, de spuitpomp, de luchtstroommeter en het calciumchloride-precipitatiebad. Controleer of er een afstand van 10 centimeter is tussen het uiteinde van de inkapselingsmachine en het verzamelpunt in de Petrischaal.

Stel vervolgens de spuitpomp in op 10 milliliters per uur. De luchtstroom op acht liters per minuut en een druk van 100 kilo pascals. Verzamel de ingekapselde cellen gedurende zeven minuten in een voorverwarmd precipitatiebad.

Breng ze vervolgens door middel van voorzichtig aspireren over naar een centrifugebuis van 50 milliliter met 20 milliliter 0,9% natriumchloride; laat de capsules naar de bodem van de buis zakken, verwijder voorzichtig het supernatant en was vervolgens eenmaal met 0,9% natriumchloride. Ga verder door de ingekapselde cellen te resuspenderen in voorverwarmd kweekmedium, aangevuld met rock-inhibitor. Breng dit over naar een kweekfles en incubeer gedurende drie dagen.

Zaai de muis stromale lijn PA six cellen uit in een T 75-fles gecoat met 0,1% gelatine en conditioneer het dopaminerge neurale differentiatiemedium gedurende 24 uur. Breng de capsules over naar een centrifugebuis van 50 milliliter en laat ze bezinken naar de bodem van de buis. Verwijder het supernatant en resuspendeer de capsules in PA six cell geconditioneerd dopaminerg neuraal differentiatiemedium.

Kweekmedium. De ingekapselde menselijke embryonale stamcellen met de PA zes cellaag gedurende 21 dagen. Bij het aanvullen van het medium dient dit te worden vervangen.

Telkens wordt slechts de helft van het medium vervangen om de PA six-cellen voort te kweken in dopaminerge neurale differentiatie. Het medium wordt gedurende één week aangevuld met inducerende factoren. Aspireer eerst de capsules en breng deze over in een centrifugebuis van 15 milliliter.

Wanneer de capsules naar de bodem zijn gezakt, wordt het supernatant weggegooid. Was twee keer met DPBS en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens vijf milliliter decapsuleringsoplossing toe en meng de suspensie grondig.

Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren van het pellet worden de decap-cellen gedecapsuleerd en tweemaal gewassen met DPBS, waarna de decap-cellen kunnen worden gebruikt als monocuulcultuur of voor directe verdere analyse. Bij een typische preparatie ligt de diameter van de alginaat-microcapsules tussen de 400 en 500 microns.

Hier wordt de C-F-D-A-P-I-assay gebruikt. De resultaten bepalen de groene levensvatbare ingekapselde cellen bij 80% analyses van levensvatbaarheid, proliferatie en apoptose van ingekapselde menselijke embryonale stamcellen op verschillende tijdstippen, wat dient om de kweekcondities te optimaliseren. Interessant is dat de effecten van de rock-inhibitor dissociatie-geïnduceerde apoptose voorkomen en de cellevensvatbaarheid behouden, met een indicatie van superieure groei van ingekapselde menselijke embryonale stamcellen gekweekt in H-F-F-C-M plus ri.

In dit voorbeeld wordt celencapsulatie toegepast als een 3D-platform om ingekapselde menselijke embryonale stamcellen te differentiëren tot dopaminerge neuronen. Zoals verwacht neemt de grootte van de embryonale lichamen in de loop van de tijd toe; bij decapsulatie vertonen de cellen na twee tot drie dagen kweek een progressieve neuronale morfologie met een levensvatbaarheid van meer dan 90%. Analyse van de genexpressie wijst op een downregulatie van de pluripotente marker OCT four.

Belangrijk is dat de neuroprogenitormarker PAX6 en de dopaminerge neuronale marker TH na zeven dagen differentiatie nog steeds opgereguleerd blijven. Verder gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen vertonen na 21 dagen meer dan 90% TH-positieve neuronen. Western blot-analyse bevestigt de gunstige expressiepatronen van TH en PAX6 in 3D- versus 2D-celculturesystemen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze effectief in twee uur worden uitgevoerd. Vergeet niet de cellen vóór en na de inkapseling te behandelen met een ROCK-remmer. Varianten van induceerders of remmers kunnen het 3D-differentiatieprotocol aanpassen voor toekomstige experimenten.

Deze specifieke techniek voor het inkapselen van menselijke ESL en het differentiëren ervan in een 3D-omgeving biedt potentieel voor celtherapie bij een reeks aandoeningen, in het bijzonder de ziekte van Parkinson.