Magnetic Resonance elastografie methodologie voor de evaluatie van Tissue Engineered Construct groei

Om technische weefselconstructies te onderzoeken, is traditionele mechanische beproeving, die vaak leidt tot de vernietiging van het monster, niet acceptabel. Deze methode maakt gebruik van microscopische magnetische resonantie-elastografie of micro-MRE als een niet-invasieve techniek voor het meten van de mechanische eigenschappen van kleine weke weefsels. Eerst worden cellen op een biomateriaalsteiger geplaatst om weefsel te genereren.

Het weefsel is gesuspendeerd in aros-gel en de punt van een actuator wordt in de gel geplaatst. Vervolgens wordt, om de beweging te karakteriseren, de actuatorbeweging overgedragen op het monster en gedetecteerd met behulp van een laser-Doppler vibrometer.

Het monster en de actuator worden overgebracht naar een magneet voor magnetische resonantie. Er worden elastografiebeelden verkregen. Analyse van de resulterende beelden laat de verandering in afschuifstijfheid zien voor zowel de osteogene als de adipogene constructen.

We kwamen eerst op het idee voor deze techniek nadat we magnetische resonantiefotografie hadden geobserveerd voor gebruik bij ziekte-diagnostiek en beseften dat dit kon worden uitgebreid naar weefselengineering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande technieken, zoals mechanische tests, is dat het de niet-invasieve technologie van MRI toepast op belangrijke mechanische eigenschappen van weefsels. De toepassingen van deze techniek strekken zich uit tot weefselengineering, omdat kennis van de mechanische eigenschappen zal waarborgen dat het geschikt is voor de beoogde toepassingen in bot- en kraakbeenevening.

Hoewel deze methoden waardevolle inzichten bieden in tissue engineering, kunnen ze ook worden gebruikt voor het diagnosticeren van ziekten in verschillende organen, zoals bijvoorbeeld leverfibrose, traumatisch hersenletsel of hersenkanker. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat deze stappen bevat die moeilijk aan te leren zijn, en voorafgaande kennis van tissue engineering en magnitude rhythm imaging vereist. Het proces voor de preparatie van het weefselconstruct bestaat uit drie hoofdfasen: de expansie van de celpopulatie, het zaaien van cellen op een biomateriaal-steiger en differentiatie door middel van chemische signaleringsmoleculen.

Na het kweken en expanderen van de cellijn worden de menselijke mesenchymale stamcellen of HMC's op een gelatinespons gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen per milliliter voor botvorming. Ongeveer drie dagen later moeten de cellen confluent op het scaffold verschijnen om differentiatie te induceren. Verwijder het medium en vervang dit door adipose inductiemedium.

Incubeer de cellen vervolgens na drie dagen bij 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium door onderhoudsmedium, bestaande uit expansiemedium met 10 µg/mL humaan recombinant insuline. Vervang na een incubatie van 24 uur het onderhoudsmedium door inductiemedium.

Herhaal deze cyclus drie keer. Vervang daarna elke twee dagen het onderhoudsmedium gedurende vier weken om osteogenese te induceren. Vervang het medium elke twee twee dagen door vers osteogeen medium voor de duur van de studie.

In deze studie duurt het onderzoek vier weken en wordt MRE wekelijks uitgevoerd. Magnetische resonantie-elastografie berust op de voortplanting van mechanische schuifgolven om lokale waarden van mechanische eigenschappen te beoordelen. Daarom moeten deze mechanische vibraties worden opgewekt en gekarakteriseerd in het betreffende weefsel met behulp van een piëzo-elektrische actuator. Om het monster voor te bereiden, brengt u de weefselkweek over naar een reageerbuis met een diameter van 10 millimeter die een vaste basis en een laag 0,5% AGROS-gel bevat.

Voeg vervolgens warme 0,5% agarosegel toe om het in te sluiten. Laat de agarosegel vijf minuten uitharden.

Voeg bij kamertemperatuur de tip van de piso elektrische buigmotor in het oppervlak van de gel in. Bevestig vervolgens de buis met het monster en de actuator aan een starre steun. Richt de straal van de laser-doppler-barometer op de tip van de mechanische actuator.

Pas de positie van het systeem aan om de sterkte van het gereflecteerde signaal, dat op de barometer wordt weergegeven, te optimaliseren. Om de reflectie te maximaliseren, kan indien nodig reflecterende tape worden gebruikt om de actuator zo in te stellen dat er onschadelijke afschuifgolven worden gegenereerd met significante amplitudes van ongeveer 250 microns. Stel de functiegenerator in om het gewenste frequentiebereik te scannen met een werkspanning van 20 volts piek-op-piek met een witruissignaal.

Voor dit experiment is het gewenste frequentiebereik 20 tot 2000 hertz. Om het gekarakteriseerde spectrum in het Polytech Rsof-programma te bekijken, selecteert u de weergave van snelheid en FFT. Begin met het vastleggen van het signaal en identificeer de resonantiefrequentie van het systeem op basis van de pieken in het spectrum.

Meet vervolgens de uitwijking van de actuator door de actuator in te stellen om een continue sinusvormige golf af te geven op de gekarakteriseerde resonantiefrequentie. Gebruik een bedrijfsspanning van 200 V piek-tot-piek en stel de door de actuator op het oppervlak van de gel gegenereerde verplaatsing in om de FFT weer te geven met de verplaatsing op de Y-as. Zodra de actuator is gekarakteriseerd, plaatst u de reageerbuis met de sample en actuator in een gleuf van een 10 mm RF-spoel en plaatst u de sample en actuator in het centrum van de MRI-scanner.

Maak een scout-opname om de locatie van het construct te identificeren. Zodra het weefselconstruct is gelokaliseerd, worden de parameters voor de acquisitie ingesteld. Een typische in vitro sagittale scan heeft een repetitietijd van 1000 milliseconden.

Echotijd van 20 tot 40 milliseconden, een plakdikte van 0,5 tot 1 millimeter en een beeldveld (field of view) van 12 bij 10 millimeter kwadraat, met een matrixgrootte van 128 bij 128 pixels. Stel voor de elastografieparameters de actuatorfrequentie in op de waarde die is bepaald door de laser-doppler vibrometer-karakterisering. Voor dit monster is één bipair nodig met een gradiëntamplitude van 50 gauss per centimeter en een MRE-vertraging ingesteld op nul.

Zet de functiegenerator in de burst-modus en pas de parameters van de functiegenerator aan zodat deze overeenkomen met de elastografie-acquisitieparameters, inclusief de frequentie en het aantal cycli. Stel de functiegenerator daarnaast zo in dat deze extern wordt getriggerd. Om een sagittaal beeld te verkrijgen, stelt u de bewegingsgevoeligheid in op de positieve plakrichting en start u de scan na de acquisitie.

Controleer de afbeelding om de signaalkwaliteit in het weefselconstruct te beoordelen. Als de afbeelding te donker is, pas dan de MR-parameters aan en voer een nieuwe scan uit. Wijzig vervolgens de sensitisatie naar de negatieve plakrichting.

Kopieer de bestanden van de MRI-scanner naar een andere computer die is uitgerust met MATLAB en voer het MATLAB-programma uit dat een complexe deling uitvoert voor het genereren van een beeld dat de voortplanting van schuifgolven weergeeft. Beoordeel het beeld op de aanwezigheid van schuifgolven en mogelijke artefacten; fase-wrapping-lijnprofielen kunnen worden uitgezet om de kwaliteit en amplitude van de golf beter te evalueren. Als er wrapping optreedt, verlaag dan de gradientamplitude en voer een nieuwe scan uit.

Indien er geen aanpassingen aan het beeld nodig zijn, wordt de grootte van de parameterarray ingesteld op acht gelijkmatig verdeelde waarden, variërend van nul seconden tot een volledige periode van de gekarakteriseerde resonantiefrequentie. Zodra de beelden zijn verkregen, wordt een scan uitgevoerd in zowel de positieve als de negatieve plakoriëntatie.

Gebruik een MATLAB-programma dat is ontworpen voor het genereren van de afschuifgolfgegevens en de bijbehorende film van de golf die zich door het monster voortplant. Dit is het bestand dat nodig zal zijn om de mechanische eigenschappen te schatten. De laatste stap van MRE is het berekenen van de afschuifstijfheid op basis van de afschuifgolfbeelden.

Begin met het invoeren van de gegevens in het MATLAB-programma dat de driedimensionale dataset zal analyseren, specificeer de beeldgevingsparameters, waaronder het gezichtsveld, de gradiënt, de amplitude en het aantal bipolaire paren, en voer de code uit. Het algoritme maakt het mogelijk om gebieden van belang te selecteren waarvoor het gemiddelde en de standaarddeviatie van elke parameter worden berekend. Teken de contouren van het weefselconstruct om het gebied van belang te selecteren.

Het gemiddelde en de standaarddeviatie van de stijfheid, de opslagmodulus en de verliesmodulus binnen het geselecteerde interessegebied worden weergegeven. Het programma biedt ook tussenresultaten, waaronder de golf na filtering, de golf na directionele filtering en lijnprofielen die helpen bij het inschatten van de getrouwheid van het herstel. Voor een nauwkeurige schatting moet de gefilterde golf glad zijn.

De standaarddeviatie van een parameter in een specifiek interessegebied is tevens een indicator voor de kwaliteit van de berekening; pas indien nodig andere parameters aan om nauwkeurige waarden van de mechanische eigenschappen te verkrijgen, zodat de veranderingen in de mechanische eigenschappen van de ontwikkelde constructen kunnen worden geobserveerd. MRE-testen werden uitgevoerd over een periode van vier weken. Deze kaart van de constructontwikkeling toont adipogene constructen (aangeduid met de letter A) en osteogene constructen (aangeduid met de letter O), met de bijbehorende magnitude-afbeeldingen, shear wave-afbeeldingen, ELA's en de gemiddelde schuifstijfheid.

De kleurkaart voor de ELA's komt overeen met het kleurenschema van de balk. De grafiek en de foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie binnen elk interessegebied van de constructen. In de loop van de tijd werden de adipogene constructen minder stijf, wat wijst op eigenschappen die vergelijkbaar zijn met vetweefsel.

Hetzelfde gold voor de osteogene constructen, die gedurende de periode van vier weken stijver werden, wat duidt op botachtige differentiatie. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer twee uur worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de actuator na deze procedure volledig te karakteriseren. Methoden zoals biochemische analyse en histologie kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden, zoals de bevestiging van mineraalafzetting.

Vergeet niet dat het werken met menselijk cellulair materiaal en MRI extreem gevaarlijk kan zijn; er moet rekening worden gehouden met de juiste BSL-2- en MRI-voorzorgsmaatregelen bij het uitvoeren van deze procedures.