Productie van Weefsel Microarrays, Immunohistochemie vlekken en Digitalisering Binnen het menselijke eiwit Atlas

Het algemene doel van deze procedure is om een efficiënte methode te gebruiken om gelijktijdig informatie over eiwitexpressie uit meerdere weefsels te verkrijgen voor een high-throughput project, zoals de human protein atlas. Dit wordt bereikt door eerst representatieve gebieden van geformalineerde en in paraffine ingebedde weefsels te selecteren. Vervolgens worden de gemarkeerde gebieden uitgestanst en de geselecteerde kernen samengevoegd tot één enkel paraffineblok, een weefselmicroarray.

Vervolgens worden er coupes gesneden uit de TMA en wordt immunohistochemie uitgevoerd. Ten slotte wordt het eiwitexpressiepatroon geanalyseerd en worden de gegevens gepubliceerd in de human protein atlas. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die de eiwitexpressie in weefsels en cellen aantonen via weefselmicroarrays en immunohistochemie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het uitvoeren van immunohistochemie vanuit enkelvoudige weefselparenblokken, is dat waardevol biologisch materiaal kan worden bespaard en de experimenten reproduceerbaarder zijn. Een ander voordeel van deze techniek is dat u kunt besparen op de kosten van de ENT en op de verwerkingstijd in het laboratorium. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Ian call Bay, een laboratoriumtechnicus uit mijn laboratorium, om een gestandaardiseerde lengte van de weefselkernen te verkrijgen.

Markeer de stylet. Het wordt aanbevolen om aan weerszijden van het paraffinblok marges van 2,5 tot 3,0 millimeter over te laten om te voorkomen dat het paraffine scheurt bij het plaatsen van de juiste ponsen. Draai de inbusbouten waarmee de pons is vastgezet los en positioneer de pons zodanig dat de groef in de naaf van de pons stevig tegen de metalen staaf in het plastic V-blok is geplaatst.

Draai de schroeven vast en zorg ervoor dat de rand van de metalen clip horizontaal staat. Plaats de ontvangende stans links en de donorenstans rechts. Gebruik de XY-instelknoppen en de bijbehorende digitale micrometer-uitlezingen om de stansen langs de X- en Y-as te bewegen.

Om de machine te resetten, drukt u op de zero a BS-knop om te schakelen tussen inches en millimeters; druk hiervoor op de inch-millimeterknop. Bij het gebruik van een pons van 1 mm voor een template van 9 bij 8 moet de afstand tussen de gaten 2 mm zijn, gemeten tussen de middelpunten van de gaten, om te voorkomen dat de ontvangende pons te ver naar beneden wordt geduwd en beschadigd raakt. Stel de maximale diepte voor het indrukken van de pons in door een lege cassette in de houder te plaatsen en de dieptestopschroef in de linkerbovenhoek van de Z-geleider te gebruiken; stel de onderste positie van de ontvangende pons in op 1 mm boven de bodem van de cassette. Nadat het relevante gebied op een weefselcoupe is geselecteerd en gemarkeerd en een template voor de productie van een tissue microarray is ontworpen, plaatst u het ontvangende blok in de houder en draait u de schroeven vast met de kleinste schroevendraaier.

Voorkom dat de schroeven te strak worden aangedraaid om te voorkomen dat de paraffine loslaat van de cassette. Duw de ontvangende punch ongeveer vijf millimeter naar beneden in het ontvangende blok en gebruik de hendel van de punch om deze heen en weer te draaien. Laat vervolgens de neerwaartse druk langzaam los, zodat de veren de punch weer omhoog kunnen bewegen.

Gebruik de stylist om de pons te legen en gooi de paraffinekern weg. Verplaats vervolgens de turret om over te schakelen naar de donorpons. Plaats daarna de donorblokbrug met het donorblok boven de houder van het recipientblok.

Gebruik een overeenkomend met hematoxyline en eosine gekleurd preparaat waarop het interessegebied is gemarkeerd om het weefsel te lokaliseren dat bemonsterd moet worden. Houd het donorblob met de linkerhand in positie en duw de punch met de rechterhand. Duw niet op de stylet. De dieptestop blokkeert de beweging van de punch niet op de juiste positie voor het donorblok; het is daarom belangrijk om te stoppen met duwen zodra de tweede markering op de stylet zichtbaar is.

Draai de hendel van de pons één keer langzaam rond. Laat de neerwaartse druk los terwijl u het donorblok nog steeds op de donorblokbrug houdt. Verwijder de brug en het donorblok.

Zorg ervoor dat de donorpons is uitgelijnd met het eerder gemaakte gat. Pas de positie van de pons aan met behulp van de stelschroeven. Als de donorpons en het gat in het recipientenblok niet zijn uitgelijnd, druk dan de pons voorzichtig naar beneden tot de punt de bovenkant van het gat in het recipientenblok bereikt.

Houd deze positie vast en gebruik de stylet om de weefselkern in het gat te legen. Het oppervlak van de kern moet in één lijn liggen met het oppervlak van het blok. Beweeg de turret terug naar de ontvangende pons.

Beweeg naar de volgende positie met de XY-instelknoppen en herhaal het proces door een monster uit het ontvangstblok te ponsen totdat de array compleet is. Om het ontvangstblok te verwijderen, worden de schroeven in de houder losgedraaid. Plaats het blok met de zijde van het weefsel naar beneden op een glazen objectglas in een geschikt rek en bak het blok 40 minuten bij 42 °C.

Haal de objectglas en het blok uit de oven en maak het oppervlak van het blok vlak door voorzichtig over het objectglas te strijken. Plaats het blok met het objectglas gedurende 10 minuten op een koelplaat. Verwijder het objectglas van het blok.

Het blok is nu voltooid en klaar voor het maken van coupes. Na het maken van de coupes volgt de kleuring en digitalisering van de tissue microarray met een antilichaam tegen een eiwit van belang. Zoek naar het eiwit in de Human Protein Atlas door naar de website www.proteinatlas.org te gaan.

Voer de naam van het ensemble-id, het UniProt-toegangsnummer of de HGNC-naam van het eiwit van belang in, bijvoorbeeld insuline. Klik op het eiwit van belang en scrol omlaag naar de samenvatting van normaal weefsel en organen. Het overzicht toont de eiwitexpressie in de pancreas.

Klik op het tabblad. Meer weefselgegevens. De weergave van normale weefsels, gesorteerd op orgaan, wordt zichtbaar.

Klik op de pancreas om de IHC-resultaten te bekijken voor drie antilichamen gericht tegen hetzelfde eiwit. Klik op een afbeelding om een afbeelding van de pancreas met een hoge resolutie te bekijken. In deze figuur worden voorbeelden van de kwaliteit van weefsel-microarrays getoond: een rechte en correct uitgelijnde array met voldoende ruimte tussen de rijen en kolommen en de rand van de paraffine. Hier staan sommige kernen te dicht bij de rand, wat waarschijnlijk leidt tot problemen tijdens het snijden.

Deze weefselmicroarray is te lang gebakken en is ingestort zonder het juiste sjabloon. Hier is een correct gesneden sectie met rechte en uitgelijnde kolommen gekleurd met hematoxyline en eosine. Een slecht of vuil mesje kan leiden tot splijting zoals hier getoond of gecomprimeerde secties zoals deze.

Kiemcentrumcellen in lymfeklieren vertonen een optimaal getitreerd antilichaam, wat resulteert in een specifieke cytoplasmatische kleuring zonder achtergrond, zoals hier te zien is. Negatieve of zwakke kleuring wordt gevonden wanneer de concentratie van het primaire antilichaam te laag is of als het doeleiwit niet aanwezig is in de immunogekleurde weefsels. Deze weefselcoupe is overgekleurd door een te hoge concentratie van het primaire antilichaam.

De donkere kleur veroorzaakt moeilijkheden bij het bepalen van de subcellulaire lokalisatie vanwege spillover, kruisreactiviteit en vals-positieve resultaten. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u een tissue marker array produceert en hoe u deze gebruikt bij het analyseren van eiwitexpressie middels immunohistochemie. U heeft daarnaast een goed inzicht in hoe u de Human Protein Atlas raadpleegt voor eiwitexpressie in menselijke weefsels en cellen.