Beoordeling van de GFP expressie en levensvatbaarheid Met behulp van de Tali Image-Based Cytometer

Deze video demonstreert een procedure voor het bepalen van de cellevensvatbaarheid in cellen die GFP tot expressie brengen met behulp van de tally image-based cytometer. GFP-getransduceerde cellen worden gekleurd met de tally viability kit dead cell red, die alle dode cellen rood kleurt met propidiumjodide. De cellen worden met een pipette overgebracht naar een tally cellular analysis slide en in de cytometer geladen, die brightfield- en rood- en groenfluorescentiebeelden vastlegt en analyseert. Vervolgens worden histogrammen gegenereerd om het celaantal, de celgrootte, de PI-fluorescentie-intensiteit en de GFP-fluorescentie-intensiteit weer te geven in vergelijking met traditionele flowcytometrie.

Tali kan vergelijkbare gegevens leveren met betrekking tot celviabiliteit en expressie. Echter biedt deze beeldgebaseerde cytometrie aanvullende visuele informatie over de onderzochte celpopulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie is dat de Tali beeldgebaseerde cytometer gelijktijdig zowel kwantitatieve als visuele informatie over uw celmonster verschaft.

Bovendien is het telinstrument eenvoudiger in gebruik, goedkoper en neemt het minder ruimte in beslag dan zowel een flowcytometer als een fluorescentiemicroscoop. Hierdoor kunnen onderzoekers snel kwantitatieve assays uitvoeren, zoals levensvatbaarheid in GFP-expresserende cellen, op het laboratoriumblad. In deze procedure werden U2 OS-cellen bij een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter getransduceerd met een nucleair gericht cell light GFP-viraal construct om dode cellen met propidiumjodide te kleuren; breng vervolgens 100 µL van de celsuspensie over naar een nieuwe microcentrifugebuis.

Let op dat voor de assay een concentratie van 1 × 10⁵ tot 1 × 10⁷ cellen per milliliter wordt aanbevolen, hoewel de concentratie niet exact hoeft te zijn. Voeg vervolgens 1 µL tally dead cell red-reagens toe. Vortex daarna kortstondig om te mengen en incubeer het mengsel van kleuringsreagens en cellen gedurende 1 tot 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Ga na de incubatie onmiddellijk over tot de analyse op de tally image-based cytometer. De tally maakt gebruik van wegwerpbundels van plastic cellulaire analyseschuifjes die specifiek voor het instrument zijn ontworpen. Zorg er altijd voor dat u het objectglas bij de randen vasthoudt bij het laden van het objectglas.

Pipetteer 25 µL monster langzaam in een van de halfronde monsterlaadgebieden. Hier worden ongesteende, niet-getransduceerde controlecellen geladen in kamer A en de gesteende GFP-expresserende cellen in kamer B. Om een levensvatbaarheidsassay uit te voeren in GFP-expresserende cellen, tikt u op G-F-P-R-F-P op het startscherm van de cytometer. De assay-opties verschijnen vervolgens aan de rechterkant; selecteer hier GFP plus levensvatbaarheid.

Het instrument vraagt vervolgens of de monsterreeks benoemd moet worden om de monsterreeks een naam te geven. Druk op "name now". Typ vervolgens via het touchscreen de naam van de monsterreeks en druk op "save"; de tally cytometer gaat dan automatisch over naar het meetscherm.

Druk vervolgens, om de achtergrondfluorescentie te meten, op het tabblad 'background' rechtsonder op het meetscherm, zoals hier te zien is. De standaardinstelling geeft aan dat er negen velden met cellen worden afgebeeld. Plaats nu de slide in de laadpoort totdat deze stopt, waarbij de controlesample van het instrument is afgekeerd.

Oefen geen kracht uit op het touchscreen op de achtergrond om een nieuwe, ongekleurde celcontrole in te voegen. De slide wordt automatisch in het instrument getrokken en een live-beeld van de cellen wordt op het scherm weergegeven. Gebruik de focusknop om de cellen tijdens het scherpstellen in het juiste beeldvlak te brengen.

Verschuif de rode zoomknop naar 4x of 16x. Om de celpopulatie beter te kunnen bekijken, moeten de cellen gelijkmatig donker zijn met een heldere halo eromheen. Zoals hier wordt getoond, kunnen cellen ondergeteld worden wanneer de overgang tussen de achtergrond en de randen van de cellen wazig is, waardoor de celgrenzen niet duidelijk gedefinieerd zijn.

Cellen kunnen overmatig worden geteld wanneer ze heldere centra en donkere randen hebben. Zodra de cellen scherp zijn gesteld, tikt u op 'run unstained cell control'. Om de achtergrondfluorescentie te meten, zal de cytometer automatisch afbeeldingen vastleggen en miniaturen van elk gezichtsveld weergeven.

De voortgangsbalk biedt een voortdurende update van de analyse. Nadat de beeldopname is voltooid, stoot de cytometer de slide automatisch uit en worden de gegevens van de analyse van de opgenomen beelden verstrekt. Opgeslagen gegevens worden weergegeven in het vervolgkeuzemenu van het tabblad achtergrond.

Aan de achtergrondcontrole krijgt dezelfde naam toegewezen als die aan het experiment is gegeven. Om het met PI gekleurde, GFP-getransduceerde monster te analyseren, verwijdert u de slide uit het instrument, draait u deze om en plaatst u deze opnieuw zodanig dat het getransduceerde monster van het instrument af is gericht. Druk op het monster-tabblad en tik vervolgens op 'press' om het nieuwe monster in te voeren.

Wanneer het beeld op het scherm verschijnt, gebruik dan de focusknop om de cellen scherp te stellen. Druk vervolgens, zoals voorheen, op 'run sample' om de monsteranalyse te starten. Nadat de beeldopname is voltooid, verschijnen de analyseresultaten onder het tabblad 'sample' enstoot de cytometer de objectglas automatisch op de juiste wijze uit.

Voer de tally-cellulaire analyseslide af. Omdat deze slides biohazardous afval zijn, kunnen ze niet worden hergebruikt. Zodra het monster is geanalyseerd, kunnen er drempelwaarden op het monster worden toegepast.

Om hier specifieke celpopulaties te analyseren, passen we de drempelwaarden aan om het percentage levende en dode cellen te bepalen. Onder het tabblad 'sample' worden het aantal en het percentage GFP-expresserende cellen, de levende en dode cellen die GFP tot expressie brengen en de totale levensvatbaarheid weergegeven. Ook de gemiddelde celgrootte, het aantal getelde cellen en de celconcentratie worden getoond.

Daarnaast worden onderaan het scherm histogrammen getoond die de celgrootte, groene fluorescentie en rode fluorescentie weergeven. Om de gate voor de celgrootte in te stellen, raakt u de thumbnail van de celgrootte aan om het histogram van de celgrootte te openen en zo eventueel debris uit te sluiten. Verplaats de blauwe schuifregelaars om zowel grote als kleine events uit te sluiten.

Tik op 'apply' om de cellen binnen de gates op te nemen. Tik vervolgens op de thumbnail van het GFP-histogram om de GFP-fluorescentie aan de analyse toe te voegen en deze te openen.

Verschuif de blauwe schuifregelaar om de drempelwaarde net rechts van de zwakste piek in te stellen. Gebruik de controlemonsters als richtlijn. Hiermee kunnen de GFP-positieve cellen in de analyse worden opgenomen, terwijl autofluorescente cellen worden uitgesloten.

Autofluorescentie wordt vaak waargenomen wanneer biologische moleculen binnen cellen worden blootgesteld aan excitatie. Pas dit toe om te bevestigen en keer terug naar het vorige scherm. De gegevens onder het tabblad monster moeten nu de gates en de drempelwaarde weerspiegelen die voor beide fluorescentiekanalen zijn ingesteld. Druk vervolgens op de miniatuurweergave van het PI-histogram om deze opnieuw te openen, om zo de PI-gekleurde cellen te scheiden van autofluorescentie of eventuele achtergrondruis in het monster.

De piek van de controlemonster zal als een grijze piek op het histogram worden weergegeven. De rode piek stelt de fluorescentie van het monster voor. De achtergrondfluorescentie wordt weergegeven als de piek die zich op dit instrument het dichtst bij de nulwaarde van de RFU bevindt.

Om de achtergrondfluorescentie in het PI-kanaal te elimineren, verschuift u de blauwe schuifregelaar om de drempelwaarde aan te passen. Om deze piek uit te sluiten, gebruikt u de grijze piek van het controlemonster als referentie. Wanneer de drempelwaarde in het PI-kanaal correct is ingesteld, tikt u op 'toepassen' om te bevestigen en terug te keren naar het vorige scherm; het telinstrument zal de gegevens opnieuw automatisch analyseren en de resultaten in het monster-tabblad bijwerken.

Druk vervolgens op het zoomtabblad om visueel te bevestigen dat elke cel correct is toegewezen, en selecteer daarna een vastgelegd gezichtsveld ter beoordeling door op de miniatuurweergave van de afbeelding te klikken. Druk vervolgens op het tabblad lagen. Druk daarna op de GFP- of PI-knop om de afbeelding weer te geven die via dat kanaal is vastgelegd.

Druk opnieuw op dezelfde knop om de laag uit het display te verwijderen of om lagen over elkaar heen te leggen; tik op de knoppen die bij elk kanaal horen om te identificeren hoe de cellen via een specifiek kanaal worden geteld. De cirkels rond de cellen die alleen via het bright-fieldkanaal zijn geteld en geen fluorescentie vertonen, worden blauw omcirkeld. Dit geeft aan dat een specifieke cel een levende cel is die tot expressie komt in het groene kanaal.

GFP zal worden omcirkeld in groene cellen die expressie vertonen in het rode kanaal. Cellen die zijn gekleurd met pi worden rood omcirkeld en zijn dode cellen die in beide worden geteld. Het rode en groene kanaal zullen geel worden omcirkeld.

Dit geeft aan dat de cel GFP tot expressie brengt, maar ook is gekleurd met pi en dus dood is. Af en toe verschijnt er een zwarte cirkel op het scherm. Dit zijn objecten die zijn geïdentificeerd, maar op basis van de celgrootte zijn uitgesloten van de analyse.

Ga verder met het nauwkeurig afstellen van de drempelwaarde op het fluorescentiehistogram via de zojuist beschreven stappen, totdat elke cel die fluorescentie vertoont, is omcirkeld met de juiste kleur. Alle analyseparameters worden automatisch op het instrument opgeslagen onder het gegevensblad.

De teller kan databestanden van 500 monsterruns opslaan. Elk bestand dat in het tabblad 'data' is opgeslagen, is beschikbaar voor heranalyse. Door het bestand uit het tabblad 'data' te selecteren, wordt het opnieuw geopend en worden alle histogrammen en lagen actief om gegevens te archiveren en rapporten te genereren.

De gegevens die in het instrument zijn opgeslagen, kunnen met behulp van een USB-stick naar een computer worden overgedragen. Vier representatieve celtypen werden getransduceerd met een GFP-viraal construct dat zich op de celkern richt, gekleurd met een tally-levensvatbaarheidskit met behulp van dead cell red-reagens en geanalyseerd met de tally in een flowcytometer, zoals hier wordt getoond. Beide methoden rapporteerden ongeveer hetzelfde percentage van de populatie voor elk celtype dat GFP tot expressie bracht, samen met het percentage van de totale populatie dat zowel levensvatbaar was als GFP tot expressie bracht.

Deze gegevens tonen aan dat de Tali-cytometer in staat is om onderscheid te maken tussen de totale GFP-expressie in een populatie en de GFP-expressie in de levende populatie. We hebben zojuist aangetoond hoe de Tali image-based cytometer kan worden gebruikt om de fluorescentie-expressie en levensvatbaarheid in uw celmonster te beoordelen. Deze technologie slaat de brug tussen individuele celstudies en populatiestudies.

Met de tally image-gebaseerde cytometer kunt u kwantitatieve en kwalitatieve visuele informatie verzamelen over individuele cellen en grotere celpopulaties. Met dezelfde procedure kunnen verschillende andere assays worden uitgevoerd, waaronder apoptose, RFP-expressie en cellevensvatbaarheid. Voor niet-exprimerende cellen omvatten de potentiële toepassingen de beoordeling van genexpressie tot studies naar geneesmiddeleffectiviteit.