Het bepalen van optimale cytotoxische activiteit van de mens Her2neu Specifieke CD8 T cellen door vergelijking van de Cr51 afgifte test aan de xCELLigence System

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cytotoxische T-celactiviteit te bepalen door een impedantiegebaseerde benadering met behulp van het EXOGEN-systeem te vergelijken met de chroomvrijgave-assay. De eerste stap wordt bereikt door perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed te scheiden met behulp van fial. Vervolgens worden de PBMC aan de wells toegevoegd samen met peptide-antigeen, menselijk recombinant IL 2 en bestraalde PBMC om antigeen-specifieke CD 8 T-cellen te creëren.

De antigeenspecifieke CD8 T-cellen worden vervolgens in beide assays gecultiveerd met tumorcellen om tumorceldood te induceren. De resultaten tonen het percentage lyse van tumorcellen aan met behulp van zowel de impedantiemethode als de chroomvrijgave-assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de chroomvrijgave-assay, is dat het impedantiegebaseerde systeem real-time gegevens verzamelt en minder cellen vereist die bovendien geen labeling nodig hebben. Voor dit protocol wordt bloed van gezonde HLA-A2-positieve donoren gebruikt als bron van PBMC's of perifere bloedmononucleaire cellen, volgens het protocol van de fabrikant.

Gebruik F call PA plus om de P BMC's van het bloed te scheiden. Breng vervolgens in zeswellplaten ongeveer 4 miljoen P BMC's over in twee milliliter medium per well. Voeg aan elke well HLAA twee bindend peptide toe voor een eindconcentratie van 10 µg/mL cultuur.

De cellen op om en om dagen behandelen om de stimulatie en expansie van T-cellen te bevorderen. Voeg vers medium toe, aangevuld met humaan recombinant IL-2 voor een eindconcentratie van 50 units per milliliter. Bereid na één week een cultuur van autologe pbmc voor, bestraal de cellen en pulseer ze gedurende twee uur met hetzelfde hla.

Restimuleer de cultuur door 1 mL van de bestraalde autologe PBM CS toe te voegen aan elke well, met een twee-bindingspeptideconcentratie van 10 µg/mL. Voeg om de dag vers medium toe, aangevuld met IL-2. Na een verdere week restimuleer de culturen op dezelfde wijze voor een tweede maal. Na nog eens zes dagen in cultuur zijn de cellen klaar voor gebruik.

Bereid het meetstation voor intelligente impedantie voor gebruik door het gedurende ten minste een uur te equilibreren op 37 °C onder 5% koolstofdioxide. Oogst 75% conflueerde menselijke tumorcellen met behulp van 0,25% trypsine en centrifugatie. Tel de tumorcellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in RPMI.

Tumormedia met een concentratie van 7.500 cellen per microliter. Vervolgens stelt de Excel agent-software in het layout-venster de indeling van de wells in. Stel de schedule-pagina zo in dat er elke vijf minuten impedantiemetingen worden verricht gedurende een periode van 40 uur; gedurende de eerste 18 uur zal het Xceligent-systeem alleen impedantiemetingen van de tumorcellen uitvoeren.

Voeg vervolgens 100 µL RPMI-tumormedium per put toe. Voer een achtergrondmeting uit op de EPL's door de impedantie te meten in afwezigheid van cellen. Nadat de tumorcellen zijn toegevoegd, plaatst u de platen in het station en begint u met het uitvoeren van de metingen.

De tumorcellen zullen onmiddellijk beginnen te hechten aan de EPL's. Na ongeveer 18 uur incubatie zullen de tumorcellen aan de EPL's zijn gehecht en zijn toegenomen tot 15.000 tumorcellen per well. Oogst op dit moment de voorbereide T-cellen door middel van voorzichtig schrapen en een agitatiecentrifuge.

Resuspendeer de T-cellen in RPMI-medium met 10% FBS en tel ze met een hemocytometer. Zodra de celdichtheid bekend is, bereidt u een tweevoudige verdunningsreeks van T-cellen voor, zodanig dat wanneer 200 µL T-cellen aan de tumorcellen worden toegevoegd, de hoogste concentratie 40 T-cellen per tumorcel is. De laatste verdunning van de reeks moet 1,25 T-cellen per tumorcel opleveren.

Pauzeer het EXOGEN-station en verwijder de EPL met een pipet. Verwijder het medium uit de wells en voeg vervolgens 200 microliters T-cellen toe, waarbij alle concentraties uit de verdunningsreeks als negatieve controle worden gebruikt. Gebruik puur medium, plaats de EPL terug in het station en vervolg het programma aan het einde van de assay.

Normaliseer de resultaten. Volg altijd de institutionele stralingsveiligheidsprocedures bij het werken met chroom 51 en met chroom 51 gelabelde doelcellen en gebruik de afscherming om de blootstelling aan straling te verminderen. Begin met het pulseren van tumorcellen gedurende twee uur bij 1 miljoen cellen per milliliter met 10 µL per milliliter vers chroom 51.

Was vervolgens de tumorcellen in 10 milliliters RPMI-medium met 10% FBS, centrifugeer de cellen en resuspendeer ze in hetzelfde medium op een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter. Breng deze vervolgens over naar een 96-well plaat met ronde bodem. Voeg 100.000 tumorcellen per well toe om de spontane afgifte te bepalen.

Voeg niets anders toe aan zes van deze putjes en aan zes andere putjes. Voeg 100 µL Triton X 100 toe aan alle overige putjes om de cellen te lyseren en zo de maximale vrijgave te berekenen. Voeg T-cellen toe aan de plaat met behulp van de eerder bereide verdunningsreeks.

Incubeer de platen nu gedurende vijf uur en neem van elke plaat monsters van 50 µL supernatant; breng de monsters over op een luma-plaat nadat de platen gedurende de nacht in de zuurkast bij kamertemperatuur zijn gedroogd. Meet de CPM met een gammacounter voor T-cellen en SKBR3-kankercellen. De kankercellen werden gekweekt op X-intelligence-platen en de celindex werd gemeten, wat een reflectie is van de plaatimpedantie, aangezien T-cellen geen adhesie nodig hebben om te prolifereren.

Hun effect op de impedantie was verwaarloosbaar gedurende een kweekperiode van 40 uur. Alleen gekweekte kankercellen vertoonden een stijgende impedantiemeting. De toevoeging van T-cellen na 18 uur doorbreekt echter deze trend.

Deze gebeurtenis vereist softwarenormalisatie na de toevoeging van T-cellen en wordt verder onderzocht in het volgende experiment. Wanneer SK BR three-cellen werden gecocultiveerd met variërende concentraties T-cellen, waren reducties in impedantie zeer duidelijk afhankelijk van de dosis T-cel; gegevens werden elke vijf minuten verzameld over drie trials bij het 10-uursmerk. Celindices volgden een tweedegraads polynoom over het bereik van T-cellen, wat aangeeft dat het Exogen station CD8 T-cel-gemedieerde sterfte van SK B three-tumoren in realtime monitort als een daling in de celindex om te bepalen of reducties in impedantie van SK BR three door de T-cellen antigeenspecifiek waren.

SK KBR-3-cellen werden gecultiveerd in co-cultuur met HLA-A2-positieve FLU-specifieke T-cellen die HER2-neu niet herkennen. Deze cellen vertoonden een significant lagere lytische activiteit. Om verder vast te stellen of HER2-neu-specifieke T-cellen op een antigeenspecifieke wijze doodden, werd een antilichaam tegen Fas-ligand aan de co-culturen toegevoegd. Het antilichaam reduceerde de lytische activiteit van de HER2-neu P360-9-specifieke T-cellen niet.

Echter, bij T-cellen die aspecifiek waren geactiveerd met anti-CD3/CD28-beads, remde het antilichaam de lysis wel, om te bepalen of de doding plaatsvond op een HLA-klasse I-afhankelijke wijze. Er werd ofwel een anti-HLA-klasse I-antilichaam of een isotype-controleantilichaam toegevoegd aan de coculturen. De resultaten ondersteunden deze hypothese sterk.

Vervolgens werden T-cellen gecokultureerd met andere kankercellen in een verhouding van één op vijf. De HLA A2-negatieve tumorcellijn BT 20 werd gebruikt als negatieve controle. De resultaten tonen aan dat de methode bruikbaar is voor meerdere doelwit-adherente tumorcellen.

Cocultures van de twee nieuwe HER2-specifieke P360 9 T-cellen werden toegevoegd aan met chromium-51 gelabelde targetcellen, gevolgd door CRA-analyse. De intelligentie-assay lijkt gevoeliger om consistentie te analyseren. De intra-assay variatie werd berekend als het procentuele variatiecoëfficiënt bij elke celratio tussen 1:40 en 1:5.

Dit werd gemeten onder de 15% bij de laagste celratio's. Echter was het percentage CV hoog of onvoorspelbaar. Daarnaast werd de variabiliteit van SK BR 3 T-cellyse door co-cultuur met verschillende P 360 9 specifieke T-cellijnen onderzocht.

De gegevens werden met een interval van 30 dagen gegenereerd. De assays werden in triplo uitgevoerd en de resultaten waren zeer vergelijkbaar. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cytotoxische T-celactiviteit kan worden bepaald met behulp van antigeenspecifieke CD8 T-cellen en tumorcellen via een impedantiegebaseerde benadering.