Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren en kwantificeren van de pool van toxine die het cytosol binnendringt. Om dit te bereiken, wordt het toxine eerst gebonden aan het oppervlak van de gastheercel bij vier graden Celsius. Het ongebonden toxine wordt vervolgens verwijderd en de cellen worden opgewarmd tot 37 graden Celsius, wat de beweging van het toxine naar het endomembraansysteem en vervolgens naar het cytosol van de gastheer mogelijk maakt. Daarna wordt digitonine gebruikt om selectief het plasmamembraan te permeabiliseren na de celpermeatie.

De celextracten worden met behulp van differentiële centrifugatie gescheiden in afzonderlijke membraan- en cytosolfracties; als laatste stap wordt surface plasma resonance (afgekort SPR) gebruikt om de entry van toxine in het cytosol te detecteren en te kwantificeren door de cytosolfractie te perfunderen over een SPR-sensor die is gecoat met een antitoxine-antilichaam. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de toxinebiologie, zoals de efficiëntie en kinetiek van de entry van toxine in het cytosol, de hoeveelheid toxine die het cytosol binnendringt en mogelijke remming van het transport van toxine naar het cytosol door geneesmiddelen. Bereid vóór de start van dit protocol de HeLa-cellen voor op celintoxicatie zoals beschreven in het schriftelijke protocol, na een incubatie van de HeLa-cellen gedurende de nacht.

Vervang het kweekmedium door één milliliter DMEM bevattend 100 nanogram per milliliter Ganglioside GM1 en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Dit verhoogt het aantal bindingsplaatsen voor choleratoxine, aangezien de GM1-receptor van de toxines zal interpoleren in het plasmamembraan van cellen die zijn blootgesteld aan een GM1-oplossing.

Na een incubatie van één uur wordt het medium dat GM one bevat verwijderd en worden de cellen tweemaal gewassen met DMEM. Voeg vervolgens één milliliter DMEM toe die één microgram per milliliter cholera-toxine bevat, en plaats de cellen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het medium dat het toxine bevat en was de cellen tweemaal.

Incubeer de cellen vervolgens in één milliliter DMEM bij 37 °C gedurende de gewenste tijd. Was aan het einde van elke chase-periode de cellen met PBS en incubeer elke well vervolgens met 250 µL 0,5 mM EDTA en PBS. Verwijder de cellen na een incubatie van 10 minuten op ijs uit de six-well plaat door krachtige trituratie met een P1000 pipetpunt.

Nadat de cellen uit één put zijn verzameld, combineert u deze met die uit de tweede en vervolgens de derde put van dezelfde conditie. Plaats daarna de gecombineerde celsuspensie van de drie replica-putten in één enkel microcentrifugebuisje. Centrifugeer het microcentrifugebuisje vervolgens vijf minuten in een tafelmodel microcentrifuge.

Bij 5.000 ×g moeten celpellets van ongeveer gelijke grootte worden verkregen voor alle condities. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet vervolgens in 100 µL van een vooraf bereide en gekoelde 0,04% werkoplossing van digitonine. Plaats de celsuspensie 10 minuten op ijs; centrifugeer de digitonine-gepermeabiliseerde cellen vervolgens met een tafelmodel microcentrifuge bij 16.000 ×g gedurende 10 minuten.

Overbreng de cytosolbevattende supernatantfractie naar een nieuwe microcentrifugebuis en bewaar de organelbevattende pelletfractie. SPR-toxine-standaarden worden bereid in concentraties van 110, 1 en 0,1 ng/mL in HCN-buffer; monsters worden bereid door cytosolbevattende supernatantfracties te verdunnen in HCN-buffer tot een eindvolume van 1 mL. Monstervolumes van ten minste 1 mL zijn noodzakelijk om ervoor te zorgen dat er geen lucht in de 500 µL monsterlus zit vóór injectie; organelbevattende pelletfracties worden resuspendeerd in 1 mL HCN-buffer die 1% Triton X 100 bevat.

De toevoeging van detergent is noodzakelijk om de in het membraan ingesloten pool van toxine vrij te maken. Bereid daarnaast parallelle sets van cytosolische en organel-fracties voor voor een controle-experiment om de getrouwheid van de fractioneringsprocedure te bevestigen, resuspendeer de cytosolische fractie in 20 µL van vier x monsterbuffer en de organel-fractie in 120 µL van één x monsterbuffer; scheid equivalente volumes van elke fractie via sodium dodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en analyseer deze met Western blot-analyse om de partitionering van een cytosolisch eiwit in de supernatant-fractie en een oplosbaar resident ER-eiwit in de pellet-fractie aan te tonen. Om de SPR-slide voor te bereiden, plaatst u eerst een vergulde glazen slide met een zelfgeassembleerde monolaag in het SPR-instrument.

Activeer de sensorplaat door gedurende 10 minuten een E-D-C-N-H-S-oplossing over de plaat te perfunderen met een stroomsnelheid van 41 µL per minuut. Voor alle volgende perfusies gebruiken we dezelfde stroomsnelheid. Verwijder de E-D-C-N-H-S-activeringsbuffer door de plaat vijf minuten te wassen met PBS met 0,05% 2020.

De plaat bevat nu reactieve MI-koppelingen als gevolg van de ontdekking door de E-D-C-N-H-S-oplossing. Perfuseer vervolgens een anti-CTA-antilichaam over de geactiveerde sensorslide in een verdunning van één op 20.000 in 20 millimolaire natriumacetaat gedurende 15 minuten. Er zal een initiële daling in de brekingsindexeenheid, afgekort als RIU, zichtbaar zijn als gevolg van de pH-verandering.

Dit zal worden gevolgd door een toename van de RIU naarmate het antilichaam wordt vastgelegd door de amide-reactieve tethers. Verwijder op de sensorslide het ongebonden antilichaam van de sensorslide met een PBST-wasbeurt van vijf minuten. Het RIU-signaal dat door het vastgelegde antilichaam wordt geproduceerd, zal afvlakken en stabiliseren, waardoor een nieuw basissignaal ontstaat.

Als laatste stap in de slide-preparatie wordt één molair ethanolamine gedurende vijf minuten over de sensorslide geperfuseerd. Hiermee worden eventuele ongebonden tethers op de sensorslide afgedekt en geïnactiveerd. Het RIU-signaal zal toenemen; om een basislijnmeting vast te stellen, wordt PBST gedurende vijf minuten over de met antilichamen gecoate sensor geperfuseerd.

Perfuseer vervolgens een experimenteel monster of een toxine-standaard gedurende 300 seconden over de sensor. Verwijder het ligand uit de buffer en perfuseer gedurende nog eens 200 seconden PBST over de sensor. Eventueel resterend gebonden toxine aan de sensor wordt verwijderd door een 102e wasbeurt met PBST bij pH 5.0.

Dit brengt het signaal terug naar de initiële basislijnwaarde, waardoor een ander monster op dezelfde sensor kan worden verwerkt. Duw, voordat u een nieuw monster laadt, een kleine hoeveelheid lucht door de monsterlus om eventuele resterende vloeistof van het vorige monster te verdrijven. Na de acquisitie.

Gegevens kunnen worden geanalyseerd met de scrubber two-software en de Igor-software kan worden gebruikt voor het voorbereiden van figuren. Pertussistoxine is een AB-toxine dat zich van het celoppervlak naar het ER verplaatst voordat de a-keten van PTs one het cytosol binnendringt.

De op SPR gebaseerde translocatie-assay kon PTs in het cytosol van geïntoxiceerde CHO-cellen detecteren. Er werd geen signaal gegenereerd vanuit het cytosol van niet-geïntoxiceerde cellen, wat de specificiteit van de anti-PTs bevestigde. Eén antilichaam vertoonde geen kruisreactiviteit met een component van het cytosol van de gastheer.

De cytosolfractie van cellen geïntoxiceerd in aanwezigheid van felden. A slaagde er ook niet in om een positief signaal te produceren, BFA voorkomt transport van toxines naar de ER-translocatieplaats, en daarmee de levering van de H-keten aan het cytosol. Chole toin is een ander ER-translocerend toxine van het AB-type.

CTA1 werd gedetecteerd in de cytosolische fractie van met CT behandelde HeLo-cellen. Dit benadrukte dat de methodologie werkt met meerdere celtypen en kan worden toegepast op elke toxine waarvoor een antilichaam tegen de keten beschikbaar is. Er werd geen signaal gedetecteerd wanneer de cytosolische fractie van CT-behandelde cellen over een SPR-sensor werd geperfuseerd die was gecoat met een anti-CTB-antilichaam, waarmee werd aangetoond dat, in tegenstelling tot de CT A1-subeenheid, het celbindende CTB-pentameer het cytosol niet binnendringt.

Na perfusie over een SPR-sensor gecoat met een anti-CTA-antilichaam. Het signaal van de organelfractie valt buiten de schaal in vergelijking met het zwakkere signaal van de cytosolische fractie. Dit is consistent met de bekende inefficiëntie van CT-transport naar de translocatieplaats van het ER, wat op zijn beurt de hoeveelheid toxine beperkt die het cytosol kan bereiken.

De tijdsafhankelijke accumulatie van getransloceerde cytosolische toxine kan ook worden gemonitord. Na blootstelling van cellen aan CT bij vier graden Celsius werd 15 minuten na het opwarmen tot 37 graden Celsius geen toxine in het cytosol gedetecteerd.

Een kleine hoeveelheid cytosolisch toxine werd gedetecteerd na 30 minuten bij 37 °C, en na chase-intervallen van 45 en 60 minuten werden progressief grotere hoeveelheden cytosolisch toxine aangetroffen. Dit demonstreert een voortdurende langetermijnlevering van celgeassocieerd toxine naar het gasthe cytosol. De assay kan ook de inhibitie van de translocatie van toxine naar het cytosol detecteren; cellen behandeld met 10% DMSO vertoonden lage niveaus van cytosol-achtig CT1 in vergelijking met de onbehandelde, geïntoxiceerde controlecellen voor de ontvouwing van het toxine.

Een keten is een voorwaarde voor translocatie naar het cytosol, waardoor de door DMSO geïnduceerde stabilisatie van CT A1 dienovereenkomstig de verplaatsing van het ER naar het cytosol voorkwam. Om de door DMSO geïnduceerde blokkade van toxinetranslocatie te kwantificeren, werd een standaardcurve gegenereerd uit bekende concentraties toxine gebruikt om een cytosolische CT A1-concentratie te berekenen van 0,3 ng/mL voor onbehandelde cellen en 0,1 ng/mL voor DMSO-behandelde cellen. De remming van de ontvouwing van CT A1 door DMSO leidde zodoende tot een drievoudige vermindering van de translocatie van CT A1 van het ER naar het cytosol.

Na deze procedure kunnen we andere technieken gebruiken, zoals intoxicatie-assays, om een direct verband vast te stellen tussen de hoeveelheid toxine in het cytosol en de activiteit van het toxine.