Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van blootstelling aan ethanol op de ontwikkeling van de zebravis te bestuderen. Dit wordt bereikt door zebravis tijdens de vroege ontwikkeling eerst bloot te stellen aan doses ethanol in normaal embryo-water. Vervolgens wordt de ethanol verwijderd en krijgen de vissen de kans om zich te ontwikkelen tot het gewenste tijdstip.

Vervolgens worden zowel grove fysieke veranderingen als wijzigingen in de genexpressie geanalyseerd in behandelde embryo's vergeleken met controle-embryo's. Ten slotte worden de embryo's gemanipuleerd met mRNA, morpholino's of geneesmiddelen om vast te stellen of de door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten kunnen worden beïnvloed. Uiteindelijk tonen een combinatie van kwantitatieve PCR en in situ hybridisatie aan dat de effecten van ethanol op zich ontwikkelende zebravissenbryo's gekoppeld zijn aan veranderingen in de genexpressie.

Vervolgende manipulatie van genexpressieniveaus kan ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsdefecten verbeteren of voorkomen. De technieken die we vandaag demonstreren, breiden onze kennis over de aard van het foetaal alcoholsyndroom uit, evenals de behouden ontwikkelingsprocessen bij vertebraten. De demonstratie zal worden gegeven door Steph Erhardt, een technicus in mijn lab, om embryo's met ethanol te behandelen.

Kweek ze vanuit wildtype paringen tot het dome-stadium bij 28 °C in embryo-water. Verdeel de embryo's van een clutch over het gewenste aantal schaaltjes, met 10 tot 50 embryo's per schaaltje. Voeg een ethanoloplossing van 0,2 tot 2,5% volume/volume in viswater toe aan de embryo's en plaats ze voor maximaal 24 uur na de gewenste blootstellingsduur terug in de incubator.

Vervang het ethanol met water door vers embryo-water gedurende een specifieke ontwikkelingsperiode om mRNA te verzamelen voor kwantitatieve PCR. Plaats de H-gematchte embryo's in einor-buisjes. Verwijder het viswater en voeg lysisbuffer met TCEP toe.

Ontkoppel de embryo's fysiek met behulp van een gemotoriseerde pulverisator en plaats ze vervolgens in de centrifuge voor een langzame spin. Breng de opgeloste stof over naar een pre-clear kolom en centrifugeer vervolgens de kolom om onthechte grote stukken te verwijderen.

Gebruik een RNA-isolatiekit om het RNA te extraheren. Synthetiseer vervolgens cDNA met standaardmethoden voor qPCR- of microarray-analyse om embryo's voor te bereiden op in situ hybridisatie en antilichaamkleuring. Fixeer embryo's van 6 tot 24 uur na bevruchting gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde bij 4 °C, gevolgd door drie wasbeurten in PBS plus 0,1% Tween.

Verwijder de choon met twee scherpe pincetten onder de microscoop. Verplaats de embryo's vervolgens naar methanol via een reeks vloeistofwisselingen met een toenemende methanolconcentratie en een afnemende PBT-concentratie. Nadat de embryo's naar 100% methanol zijn overgebracht, bewaart u ze bij -20 °C om het kraakbeen te kleuren.

Kweek de embryo's tot vijf of zes dagen na bevruchting. Fixeer ze gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Was ze vervolgens drie keer in PBT om vast te stellen welke genexpressieniveaus zijn veranderd door blootstelling aan ethanol.

Voer QPCR uit door eerst primers te ontwerpen om de primers te valideren. Test deze op drie biologische monsters. Deze biologische controlemonsters kunnen van elke leeftijd zijn, zolang het gen van belang op die specifieke leeftijd tot expressie komt.

Zodra de primers zijn geverifieerd, wordt het eerder geprepareerde cDNA gebruikt om qPCR uit te voeren, waarbij monsters in triplikaat worden geanalyseerd en een controlemonster voor zebrafish wordt opgenomen. We gebruiken de primers voor gap dh. Normaliseer de resultaten ten opzichte van de gap DH-niveaus. Bereken vervolgens het relatieve niveau van genexpressie met de powerful methode.

Variatie op twee delta delta CT die het verschil tussen de experimentele groep en het wildtype weergeeft. Voor in C twee hybridisatieconstructen. Gemarkeerde riboprobes voor het gen van belang.

Incubeer ze vervolgens met embryo's van dezelfde leeftijd onder standaardcondities en detecteer het hybridisatiepatroon met behulp van alkalische fosfatase; beeld de monsters af met een dissectiemicroscoop om de morfogene ontwikkeling te beoordelen, zoals de vorm van de snuit. Beeld levende embryo's af om de interoculaire afstand en lichaamslengte te bepalen. Fixeer de embryo's eerst in paraformaldehyde. Verzamel vervolgens beelden om de effecten van alcoholbehandeling op de ontwikkelende kraakbeenstructuren in de larvekleuring te onderzoeken.

Fixeer de zebravis met lc en blauw gedurende enkele uren tot overnacht om de embryo's te fixeren en te klaarmaken voor beeldvorming. Analyseer celdood in levende embryo's door deze één uur te incuberen in vijf milligram per milliliter aine orange in PBS. Was de embryo's drie keer met PBS, monteer de embryo's vervolgens op objectglazen, beeldvorm de monsters met een confocale microscoop en gebruik Z-stapels om composieten te maken.

Nadat genen zijn geïdentificeerd waarvan de expressie is afgenomen door blootstelling aan ethanol, injecteert u 25 tot 200 picograms per nanoliters gecapt mRNA voor een gen van belang in het één- tot tweecelstadium. Laat de eitjes herstellen in een op 28 °C verwarmde incubator totdat ze het dome-stadium bereiken en behandel ze vervolgens zoals eerder beschreven met ethanol. Voor genen waarvan de expressie is toegenomen als gevolg van blootstelling aan ethanol, kunt u deze knock-down uitvoeren door picogram- tot nanogramhoeveelheden antisense morphino's te injecteren in embryo's in het één- tot tweecelstadium.

Dit protocol is vergelijkbaar met dat voor gecapt mRNA. Indien u een mRNA of een splicing morphino injecteert, meet dan de efficiëntie met behulp van R-T-P-C-R om de hoeveelheden gesplicte en ongesplicte transcripten te vergelijken ter analyse van dosisafhankelijke genactiviteit; titreer de geïnjecteerde morphino en laat de embryo's zich ontwikkelen tot een gewenste fase voordat ze met ethanol worden behandeld. Blootstelling van zebravisembryo's aan ethanol resulteert in een reeks ontwikkelings- en genetische defecten die gerelateerd zijn aan de fenotypes die worden gevonden bij andere gewervelde dieren.

Abnormale ontwikkeling van axiale weefsels, waaronder Noor, leidt tot een verkort en soms onderbroken noord, wat gedeeltelijk bijdraagt aan de latere abnormaliteiten in de somieten zoals hier getoond. Terwijl de onbehandelde controles een sterke chevronvorm vertonen, krijgen de met ethanol behandelde somieten het U-vormige uiterlijk dat wordt gezien bij verminderde sonic hedgehog-signalering. Zoals hier te zien is.

Een ander gevolg van blootstelling aan ethanol, mogelijk downstream van vroege ontwikkelingsvertraging en daaropvolgende Noor-defecten, is een verkorte embryo-lengte. Deze bevinding is vergelijkbaar met het aanhouden van de prepubertaat en de kleine gestalte bij kinderen die tijdens de ontwikkeling aan ethanol zijn blootgesteld, wat suggereert dat het zebravismodel relevant is voor het begrijpen van deze menselijke geboorteafwijking. In diermodellen is aangetoond dat ernstige blootstelling aan ethanol leidt tot uitgesproken fenotypes van het foetaal alcoholsyndroom, inclusief synthia en opia.

Bij zebravissen neemt de intraoculaire afstand of IOD af op een ethanol-dosiseafhankelijke wijze, wat consistent is met de aard van het menselijke geboortedefect. Opia wordt alleen waargenomen bij zeer hoge doses, maar lagere doses veroorzaken wel een significante afname van de IOD, wat suggereert dat dit diermodel een vergelijkbaar defect vertoont in de ontwikkeling van de centrale gezichtslijn. In deze figuur worden de vroege genexpressieniveaus van six3b en glee1 vergeleken in onbehandelde en met ethanol behandelde embryo's.

Beide genen vertoonden een verminderde expressie in de met ethanol behandelde monsters. Met behulp van NC twee hybridisatie werden de expressiepatronen voor six three B en gooID geanalyseerd, zoals hier te zien is. Hierbij vertoonden beide genen een afname in de ruimtelijke expressie in ethanol-behandelde embryo's vergeleken met onbehandelde controles.

Omdat beide genen tot expressie komen in weefsels die bestemd zijn om craniofaciale middenlijnweefsels te worden, is hun reductie acht uur na bevruchting consistent met de reductie van IOD later in de ontwikkeling. Zodra genen die door ethanol worden beïnvloed zijn geïdentificeerd, zijn er mechanismen waarmee hun expressie kan worden verhoogd of verlaagd. In dit voorbeeld werd mRNA geïnjecteerd voor sonic hedgehog, een ligand dat de niveaus van glee one verhoogt, wat de grove defecten als gevolg van reducties in glee one bij ethanol-behandelde embryo's herstelde.

Injectie van six3b was echter niet in staat om het door ethanol veroorzaakte fenotype te herstellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de genetische en ontwikkelingsdefecten kunnen worden onderzocht die door ethanol in een ontwikkelende zebravisembryo worden veroorzaakt. De hier gebruikte technieken kunnen ook worden toegepast door onderzoekers die de toxiciteit van andere wateroplosbare verbindingen in het ontwikkelende embryoon van gewervelden willen bestuderen.