Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

Het algemene doel van het volgende experiment is om aan te tonen hoe stikstofmonoxide-metabolieten accuraat en specifiek in biologische monsters kunnen worden gedetecteerd. Dit wordt bereikt door bloedmonsters direct na afname te verwerken om verlies van metabolieten of de vorming van artefacten te voorkomen. Gelijktijdig wordt een snelle en efficiënte weefselwinning uitgevoerd om de effecten van een hypoxische omgeving op de stikstofmonoxide-metabolieten te minimaliseren.

Aortaringen worden verzameld en opgehangen in een organenbad om hun endotheelfunctie te beoordelen. Daarnaast worden biochemische assays gebruikt om de nitraatspiegels, nitrietspiegels en de relatieve spiegels van nitrothiolen en andere genitroseerde producten in het weefsel te kwantificeren. Door gebruik te maken van deze assays kan een juiste vergelijking tussen experimentele dieren en controledieren waardevolle informatie opleveren over de productie en het metabolisme van stikstofmonoxide.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze multisysteembenadering ten opzichte van enkelvoudige methoden of assays is dat dit een breder beeld geeft van de biochemie van stikstofmonoxide in meerdere organsystemen. Zo kunnen we beginnen te begrijpen welke van deze metabolieten mogelijk prognostische of diagnostische waarde hebben, en hoe het repertoire van stikstofmonoxidemetabolieten de vorming en beschikbaarheid van endotheliaal stikstofmonoxide weerspiegelt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien elke stap in het proces cruciaal is voor het behoud van de integriteit van het monster.

Sommige van deze stappen zijn niet duidelijk uit het lezen van de methodensectie in een typisch tijdschrift vanwege de fijne details van de monstername en weefselextractie. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Hong Jing, een senior onderzoeker in mijn laboratorium. Zorg ervoor dat voor dit protocol een persoon of experimenteel dier beschikbaar is voor bloedafname; bij experimentele dieren zullen ook de weefsels worden onderzocht.

Verzamel eerst volbloed door een naald van 25 gauge in de vena cava inferior in te brengen. Zodra er 500 tot 1000 microliters zijn verzameld, wordt het dier bloedvrij geperfuseerd door fysiologische buffer via de apex van de linker ventrikel in te brengen, waarbij volledige vervanging van het bloed plaatsvindt terwijl bloed en buffer via de vena cava inferior uitstromen. Het veneuze bloed dient direct na verzameling te worden opgevangen in centrifugebuisjes van 1,5 milliliters die NEM en EDTA bevatten.

Centrifugeer het bloed na centrifugatie zeven minuten lang bij 14.300 RCF. Zuig het plasma met een pipet op vanuit het pellet van rode bloedcellen en breng dit over naar een aparte buis. Bereid de geïsoleerde plasmaproeven voor op HPLC door eerst een gelijk volume koud methanol toe te voegen aan 50 µL van de plasmaproef.

Vortex het mengsel krachtig gedurende drie tot vijf seconden totdat het troebel is. Centrifugeer het mengsel vervolgens bij 14.300 RCF gedurende zeven minuten. Om de plasmaproteïnen neer te slaan, wordt de supernatant verzameld in een aparte buis van 1,5 milliliter en bewaard bij vier graden Celsius tot de analyse kan plaatsvinden.

Om het plasma voor chemiluminescentie-analyse voor te bereiden, neemt u het resterende plasmavolume, dat ongeveer 200 tot 400 microliters moet zijn, en verdeelt u dit in twee delen. Bereid één helft van het plasma voor door een volume van 10% 5%gezuurd sulfide toe te voegen en 10 minuten te wachten. Dit monster is nu klaar voor CLD-analyse.

Bereid de andere helft van het plasma voor door na vijf minuten 10% volume van 2% kwikchloride toe te voegen. Voeg bij kamertemperatuur een 10% volume van aangezuurde sulfonamide toe. Wacht nog eens 10 minuten en injecteer deze monster in de CLD op dezelfde wijze als het plasma.

Het RBC-pellet kan worden voorbereid voor HPLC en CLD voor beide analyses. Begin met het mengen van één deel celpellet met vier delen hypotone lysisoplossing. Vortex het mengsel grondig voor CLD-analyse.

De voorbereiding van de cellen is hetzelfde als die voor plasma. Begin met het toevoegen van een gelijk volume methanol. Vortex vervolgens het mengsel krachtig gedurende drie tot vijf seconden, gevolgd door centrifugeren gedurende zeven minuten bij 14 300 RCF.

Pipette nu de supernatant af en bewaar deze bij vier graden Celsius tot de analyse via HPLC om de weefselgehaltes van stikstofmonoxide-metabolieten te bepalen. Bij de relevante weefsels van proefdieren moet het bloed eerst worden afgenomen en voorbereid zoals beschreven in de vorige sectie; de oogst van de weefsels dient op gebruikelijke wijze te gebeuren, waarbij speciale aandacht moet uitgaan naar snelheid en efficiëntie om te voorkomen dat de weefsels hypoxisch worden. Homogeniseer de verzamelde weefselmonsters vervolgens in een verhouding van één op vijf met PBS die N-E-M-E-D-T-A bevat.

Bereid vervolgens de gehomogeniseerde weefsels voor op HPLC- en CLD-analyse, zoals beschreven in de vorige secties voor RBC's. Nadat een volwassen muis is geanestheseerd met dathylether en is bevestigd dat deze niet reageert op een knijpreflex in de teen, wordt een thoracotomie uitgevoerd. Er wordt een middenincisie gemaakt vanaf het sternum tot aan de regio van het schaambeen om de borst- en buikholte bloot te leggen.

Perfuse vervolgens het dier met zuurstofrijk Krebs Alite-buffer. Gebruik een spuit van 25 gauge om de buffer in de apex van de linker ventrikel te injecteren. De rechter atrium moet zijn opengesneden om een uitgang voor het bloed te bieden.

Isoleer na de perfusie de abdominale aorta door de lever, longen en andere weefsels die de aorta kunnen bedekken weg te snijden en te verwijderen. Houd vervolgens het hart vast met een pincet en snijd de aorta voorzichtig los van de achterwand van het dier. Plaats het hart en de aorta in een Petrischaal gevuld met ijs.

Koud Krebs-buffer in de schaal. Snijd voorzichtig het vet en de adventitia weg van de aorta en maak deze schoon. Voorkom dat het endotheel aan de binnenzijde van het vat wordt beschadigd tijdens het schoonmaken.

Houd het metabolisme van de aorta laag om hypoxie te voorkomen door deze elke vijf minuten over te brengen naar vers, ijskoud, zuurstofrijk buffer. Gebruik nu een scalpel om de aorta in ringvormige segmenten van drie millimeter lang te snijden. Breng de segmenten over naar een vierkanaals weefselbad van 10 milliliter gevuld met zuurstofrijke Krebs-buffer.

Gebruik de transducerknop om 1,5 gram voorspanning op elke aortaring aan te brengen. Op basis van empirische bevindingen is 1,5 gram de geschikte startspanning voor een optimale vasomotorische functie.

Monitor en registreer de krachtmeting bij de muis met behulp van een achtkanaals octale brug en data-acquisitiesoftware, laat de ringen 80 minuten equilibreren waarbij de buffer elke 20 minuten wordt vervangen, en ga vervolgens over tot de experimenten. Nadat de weefselspanning is geëquilibreerd, voegt u 100 nanomolair fennel rine toe aan elke ring voor een submaximale contractie. Zodra de ringspanning is gestabiliseerd en er sprake is van een constant tonusniveau, voert u een dosis-responsanalyse uit met een endotheelagonist zoals acetylcholine.

Hiermee worden de productie van stikstofmonoxide en de mate van vaatrelaxatie bepaald. Spoel na de dosis-responscurve voor acetylcholine de baden spoelt met Krebs-buffer en voeg 100 nanomolair venkel-extract toe aan elk organenbad om de vaten te laten contraheren. Bepaal vervolgens opnieuw de responsiviteit van de gladde spierringen op een exogene bron van stikstofmonoxide, zoals natriumnitroprussiad, met en zonder ODQ, een remmer van oplosbaar guanylaatcyclase.

Deze benadering stelt een relaxatiewaarde van 100% voor de vaten vast en demonstreert tevens de essentiële rol van oplosbaar guanylaatcyclase bij het bemiddelen van de reactie van stikstofoxide op vasculaire relaxatie. Aangezien ODQ de relaxatie door natriumnitride als reactie op acetylcholine voorkomt, relaxeerden aortaringen van gezonde controlemuizen, terwijl aortaringen van muizen met endotheliale dysfunctie een verminderde relaxatie vertoonden als gevolg van een afname in de productie van stikstofoxide. Groepspecifieke denitratisatie-assays werden tevens uitgevoerd op de controledieren middels chemiluminescentie van nitriet.

RSNO en RNNO werden gedetecteerd met een reductieve denitroseringsassay. Door piekgebieden van elkaar af te trekken, werden de nitriet- en rSNO-niveaus gemeten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van stikstofmonoxide en vasculaire biologie, zoals hoe circulerende niveaus van deze stikstofmonoxidemetabolieten de weefselniveaus weerspiegelen en hoe metabolieten veranderen bij verschillende ziektebeelden?

De bepaling van de steady-state concentraties en de halfwaardetijd van deze relevante stikstofmonoxide-metabolieten in meerdere orgaansystemen en gedurende de circulatie van één enkel dier maakt de identificatie mogelijk van specifieke moleculaire handtekeningen van ziekteprocessen en helpt ons bij het definiëren van nieuwe behandelmodaliteiten op basis van stikstofmonoxide, waardoor de clinicus wordt voorzien van betere biomarkers voor de ernst of progressie van de ziekte. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in het veld van stikstofoxiden moeite hebben, omdat veel methoden niet gevoelig genoeg zijn om deze lage niveaus van stikstofoxide-metabolieten in biologische monsters te detecteren en te kwantificeren. Ten eerste zal iemand zonder ervaring in deze techniek waarschijnlijk artefacten creëren tijdens de verwerking van de monsters, wat leidt tot foutieve gegevens en een verkeerde interpretatie van de data.